论文部分内容阅读
本论文旨在探寻适于芸豆蛋白资源利用的途径。研究了芸豆球蛋白(Phaseolin)和分离蛋白(KPI)的物化和功能特性及其相关机制,探讨了KPI的物化改性及其相关构效机理。主要研究结果如下:对芸豆球蛋白和KPI的物化和功能特性进行了分析和比较,从蛋白结构与功能性关系角度揭示了两者功能性差异的机制。结果表明,芸豆球蛋白具有良好的功能特性,其溶解度(PS)、乳化活性指数(EAI)、乳化稳定性指数(ESI)和凝胶能力均显著高于KPI (P < 0.05);芸豆球蛋白的变性焓变(ΔH)为20.3 J g-1,而KPI的ΔH仅为11.2 J g-1;芸豆球蛋白的暴露巯基(SHE)、总离巯基(SHT)和二硫键(SS)含量显著低于KPI(P < 0.05)。圆二色光谱(CD)、荧光光谱和表面疏水性(H0)分析表明,KPI是部分变性的,其制备过程中的酸碱处理导致蛋白分子伸展、H0增加及三级结构的改变。蛋白变性是导致KPI功能性降低的原因。运用溶解度(PS)、比浊法、热分析(DSC)、荧光光谱和CD光谱法探讨了不同压力微射流处理(HM)对KPI构象和功能特性的影响。HM诱导不溶性蛋白聚合物解聚,增加了KPI的PS和EAI;CD和荧光光谱分析表明,HM对KPI的二级、三级结构没有明显的影响;DSC表明,蛋白的Td和ΔH均未受到显著的影响(P > 0.05)。研究了高静压处理(HP)对KPI物化和功能特性的影响,通过Try荧光光谱、ANS荧光光谱和SHE分析以揭示HP导致KPI构象改变的规律。结果表明,200 MPa处理诱导KPI中的可溶性高聚物(空体积处)解离,而400和600 MPa处理导致的不溶性聚集物解离,改善KPI的PS;200和400 MPa处理改善KPI的EAI和ESI,而600 MPa处理造成EAI和ESI下降;400和600 MPa处理降低KPI消化性能。HP导致KPI分子伸展、SHE和H0的增加,但仅600 MPa处理导致KPI三级结构的改变;HP不影响KPI的Td,降低KPI的ΔH,但600 MPa处理KPI的ΔH高达11.2 J g-1(约占对照KPI的60%)。在酸酐-蛋白比为0~0.1(乙酰化)和0~0.2(琥珀酰化) g g-1时,N-酰化度从0迅速增至93~94%;再增加酸酐与蛋白比,N-酰化度仅增加2~3%,羟基(Thr, Ser)开始参与酰化反应。酰化诱导KPI的PS-pH曲线向酸性偏移;S-KPI(琥珀酰化)的PS随酸酐-蛋白比的增加而增加,而A-KPI(乙酰化)的PS却是先增加后降低;酰化(尤其琥珀酰化)显著改善KPI的EAI(P<0.05);琥珀酰化弱化KPI的凝胶能力,而乙酰化改善KPI的凝胶能力;酰化改善KPI的体外消化性能。酰化蛋白的Iep随N-酰化度增加而线性降低,羟基酰化不影响KPI的Iep;在相同的N-酰化度,S-KPI具有与A-KPI相似或略低的Iep;酰化导致KPI的Zeta电势-pH曲线整体向下平移,回归分析表明,酰化蛋白的Zeta电势随N-酰化度的增加而线性增加(pH 7.0)。酰化影响KPI的亲水/疏水平衡。ε-氨基(lys)酰化阶段,KPI的H0逐渐下降;在羟基酰化阶段,琥珀酰化导致H0下降,乙酰化却导致H0增加。荧光光谱分析表明,ε-氨基酰化不影响KPI的三级构象,羟基酰化诱导KPI分子伸展和三级构象的改变,CD研究印证了这一结果。DSC也表明ε-氨基酰化不影响KPI的Td;羟基酰化导致KPI的Td和ΔH逐渐下降,表明蛋白变性(或分子伸展)。总之,HM、HP、乙酰化和琥珀酰化都可改善KPI的PS、EAI和ESI,琥珀酰化的改性效果最明显,其PS、EAI和ESI是接近于芸豆球蛋白的。四种技术手段均可诱导不溶性聚集物解离,HM不影响KPI的构象;HP导致KPI分子伸展,600 MPa处理导致KPI三级结构的改变;在羟基酰化阶段,乙酰化和琥珀酰化导致KPI分子伸展及三级结构的改变。