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布鲁氏菌病是能够危害多种动物并在世界范围内广泛传播的人兽共患传染病。近年来国内外布鲁氏菌病疫情呈逐年上升趋势,已经成为严重的公共卫生问题。现在,主要以血清学检测方法对布鲁氏菌病进行检测。但是,血清学检测方法不能将布鲁氏菌强毒株感染与接种布鲁氏菌弱毒疫苗的机体进行有效区分。寻找能够区别诊断布鲁氏菌自然感染与疫苗接种的方法或者分子靶标已成为布鲁氏菌病有效防控的研究热点。本课题组在前期研究中建立了布鲁氏菌强、弱毒株感染羊血液白细胞层抑制差减杂交c DNA文库(suppression subtractive hybridization,SSH),文库中筛选得到了溶血磷脂酶I(Lysophospholipase I,LYPLA1)和过氧化物氧还酶6(Peroxiredoxin 6,PRDX6)基因部分c DNA片段。LYPLA1也叫做酰基蛋白硫酯酶(Acyl-Protein Thioesterase,APT1),是一种具有重要生物学作用的多功能酶。PRDX6具有多种生物学功能,是一种重要的抗氧化活性酶,抗DNA损伤,并且在肺磷脂代谢中具有重要作用。PRDX6与多种疾病相关,可作为多种疾病的生物标志分子。在蛋白结构方面,PRDX6与LYPLA1蛋白序列中均含有GXSXG脂酶基序,在三维结构中均含有由Ser-Asp-His三个氨基酸组成的三联体催化中心。因此,本研究拟以LYPLA1和PRDX6为研究对象,对其生物功能活性以及在布鲁氏菌感染宿主后两基因的差异表达情况进行分析,为以后更深入研究LYPLA1和PRDX6基因功能以及与布鲁氏菌病之间的关系提供实验基础及科学依据。1.羊LYPLA1分子克隆、表达和单克隆抗体制备首次利用RACE技术克隆获得羊LYPLA1(Oa LYPLA1)全长c DNA序列,提交Gen Bank,申请登录号:KJ000742。Oa LYPLA1全长c DNA序列共2457 bp,包括一个长度为24 bp的5′非翻译区(UTR),一个包含poly(A)尾序列的长度为1740 bp的3′UTR,一个长度为693 bp的开放阅读框,编码230个氨基酸。Oa LYPLA1蛋白预测的分子量为24,625.78 Da。重组蛋白Oa LYPLA1被成功诱导表达并纯化。利用卵黄/琼脂扩散实验验证了Oa LYPLA1蛋白的磷脂酶活性。利用细胞融合技术筛选得到分泌抗Oa LYPLA1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4A3,抗体亚型鉴定结果为Ig G1。通过Western-blot分析单克隆抗体与重组蛋白以及天然蛋白结合的特异性。的Western-blot检验结果说明,本研究制备的单克隆抗体能够与重组Oa LYPLA1蛋白以及天然组织蛋白进行特异性的结合。2.羊LYPLA1和PRDX6时空特异性表达分析分别对Oa LYPLA1和羊PRDX6(Oa PRDX6)在羊组织中的表达分布情况进行了分析,实验结果表明Oa LYPLA1和Oa PRDX6都能在羊组织内广泛表达,并且Oa LYPLA1在肾脏组织中含量最高,Oa PRDX6在肺组织中含量最高。本研究分析了强、弱布鲁氏菌感染羊后血液白细胞中Oa LYPLA1和Oa PRDX6两个基因在转录水平的变化情况。结果表明布鲁氏菌强、弱毒株感染之后,都会引起Oa LYPLA1的下调表达,但下降程度并不完全相同。强毒株感染组中Oa PRDX6表达上调而弱毒株感染能够使Oa PRDX6基因下调表达。实验结果证明布鲁氏菌能够影响Oa LYPLA1和Oa PRDX6转录水平发生变化,因此,Oa LYPLA1和Oa PRDX6可能在宿主对布鲁氏菌感染过程中的免疫应答中具有重要作用,但是具体的作用机制并不清楚,仍待进一步研究。3.LYPLA1基因敲除小鼠巨噬细胞系RAW 264.7的建立利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将含有sg RNA序列以及编码Cas9蛋白序列的PX459重组质粒电穿孔转染进入小鼠RAW 264.7细胞,最终筛选得到了敲除LYPLA1基因的RAW 264.7小鼠巨噬细胞,并通过测序对潜在脱靶位点进行验证。结果证明可以应用CRISPR/Cas9技术建立基因敲除的RAW 264.7细胞模型。以布鲁氏菌弱毒株S2和大肠杆菌感染LYPLA1基因敲除的巨噬细胞,研究表明,LYPLA1基因对巨噬细胞清除胞内细菌的能力有一定影响。敲除LYPLA1基因能够增强巨噬细胞对胞内布鲁氏菌弱毒株S2的清除能力,但是降低对胞内大肠杆菌的清除能力。4.羊PRDX6表达、生物学活性及启动子分析成功表达并纯化了融合His6-tag标签的Oa PRDX6H蛋白,通过体外金属催化的氧化损伤实验(MCO)分析验证了Oa PRDX6H重组蛋白保护DNA免受氧化损伤的活性。为了今后研究Oa PRDX6基因表达调控机制,本实验对Oa PRDX6启动子的启动活性进行了验证。成功克隆长度约为3.4 kb含有部分Oa PRDX6 m RNA序列的羊Oa PRDX6 5′端侧翼区序列,并将其提交Gen Bank,申请序列登录号KM459018。通过基因逐步截短,构建了8个含不同长度Oa PRDX6 5′端侧翼区基因片段的重组质粒,通过检测报告基因SEAP的表达情况,证明了Oa PRDX6启动子序列中具有基础启动活性的关键序列存在于-108 nt与-36 nt区间。本研究对布鲁氏菌感染羊差异表达基因Oa LYPLA1和Oa PRDX6的分子特性进行研究,建立了LYPLA1基因敲除RAW 264.7细胞模型。本研究为进一步研究LYPLA1和PRDX6与布鲁氏菌感染之间相互关系及其机制提供了理论依据以及实验基础。