抑制食源性病原菌的海洋微生物的筛选及相应活性物质研究

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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌(Salmonella)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是目前食品中常见的食源性病原菌,它们通常会引起人类产生呕吐,腹泻以及腹痛等症状,严重可导致死亡,给人体健康和生命安全带来了极大的威胁。此外,伴随着抗生素的广泛使用,耐药性菌株的不断出现,给食源性病原菌的防控带来了极大困扰。本研究拟从海洋微生物中筛选对食源性病原菌具有显著抑制作用的微生物,并对其展开深入研究,主要内容如下:本实验首先从深海沉积物中分离并筛选到一株对食源性病原菌具有强烈抑菌效果的芽孢杆菌,根据形态学及16S r RNA序列鉴定,此菌株被命名为Bacillus sp.YJ17。随后,Bacillus sp.YJ17的发酵液经酸化、干燥、甲醇浸提和反相高效液相色谱纯化,得到了两种抑菌活性显著的组分。最后,这两种组分经高能碰撞诱导解离质谱和串联质谱分析,结果显示这两种活性物质分别属于丰原素(fengycin)和表面活性素(surfactin)家族,且肽链的氨基酸序列分别为Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gln-TyrIle和Glu-Leu/Ile-Leu/Ile-Leu/Ile-Val-Asp-Leu/Ile。此外,纯化后的fengycin和surfactin与商业化的食品防腐剂nisin相比,Bacillus sp.YJ17产生的fengycin和surfactin在抑制病原菌的生长方面表现出独特的优势,具有更广的抑制谱。为了探究Bacillus sp.YJ17产生的fengycin和surfactin拮抗食源性病原菌的作用机制,本研究首先通过电镜观察它们分别对P.aeruginosa PAO1和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)细胞的形态学和超微结构影响,结果表明经纯化的fengycin处理后,P.aeruginosa PAO1细胞形态异常聚集,细胞表面凹凸不平甚至破裂;经纯化的surfactin处理后,MRSA细胞聚集在一起,细胞表面变得粗糙、呈锯齿状。荧光显微镜观察结果进一步表明纯化的fengycin和surfactin均能引起P.aeruginosa PAO1和MRSA细胞内活性氧的积累和细胞膜的损伤。此外,分别经fengycin和surfactin处理后P.aeruginosa PAO1和MRSA细胞内活性氧清除相关酶类如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性显著降低。以上结果表明,fengycin和surfactin的抑菌机制与活性氧的积累密切相关,这可能是由于经过fengycin和surfactin处理后,指示菌细胞内过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性降低所致。由于脂肽的产量通常较低,为了提高的fengycin和surfactin的产量,本研究对Bacillus sp.YJ17的发酵培养基进行了优化实验。通过在LB液体培养基的基础上,加入不同类型的碳氮源和氨基酸,分别测定它们对fengycin和surfactin产量的影响。结果显示,碳源葡萄糖的添加均能显著提高fengycin和surfactin的产量;此外,蛋白胨、酵母膏、谷氨酸钠等氮源的添加以及谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的添加均能明显提高fengycin和surfactin产量,尤其是蛋白胨和酵母膏的添加可使fengycin的产量提高约14-16倍。综上所述,本研究从Bacillus sp.YJ17中纯化到fengycin和surfactin两种抑菌活性物质,它们对多种食源性病原菌均表现出较强的抑菌活性,表明它们在食品防腐领域具有较好的应用前景。
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