研究背景和目的:犹素化（Ufmylation）,即犹素（Ubiquitin-foldmodifier 1,UFM1）通过异肽键共价连接于蛋白质底物,是最晚被鉴定的一种类泛素修饰,由一系列酶介导的级联反应生成,并经犹素特异性蛋白水解酶（UfSPs）去除。蛋白质犹素化在众多生理过程中发挥重要的调控作用,而其异常与很多疾病密切相关,这使得犹素特异性蛋白酶成为潜在的治疗靶点。为阐明犹素修饰的催化和识别机制,基于犹素的蛋白质探针和犹素修饰蛋白底物是不可或缺的分子工具。因此,本论文的主要目的是通过发展针对犹素修饰的蛋白质化学合成策略,开发特异性靶向去犹素化酶的分子探针,同时建立重要的犹素修饰蛋白（如犹素修饰组蛋白）的化学合成方法,为犹素修饰的识别和催化机制研究提供独特的化学工具和必要的蛋白底物。研究方法:本论文中涉及的多种犹素探针和犹素修饰底物通过蛋白质化学合成进行制备,主要技术包括多肽固相合成、酶促化学反应和多肽酰肼连接等。两片段连接策略或酶促化学反应被发展用于合成两种多功能的犹素衍生物,包括C末端甘氨酸缺失的犹素酰肼UFM1Val82-NHNH2和全长的犹素酰肼UFM1Gly83-NHNH2。在此基础上,整合酰肼活化后氨解、多片段连接、辅基介导的位点特异性犹素化等技术合成多种犹素探针及犹素修饰组蛋白。随后,以重组表达的去犹素化酶或酶过表达的细胞验证合成探针的活性,而犹素修饰组蛋白则以核小体组装等生化测试进行功能验证。研究结果:基于犹素探针和犹素修饰蛋白的结构特征,犹素酰肼UFM1Val82-NHNH2和UFM1Gly83-NHNH2是设计与合成犹素衍生蛋白分子的关键活性前体。针对前者,我们开发了两片段多肽酰肼连接的高效化学全合成策略,并以其作为多功能模块通过氨解反应分别合成了 C端偶联炔丙胺的犹素活性探针（UFM1-PA）和C端偶联香豆素的荧光探针（UFM1-AMC）。生化实验表明UFM1-PA能共价捕获细胞裂解液中过表达或内源的去犹素化酶,且具备特异性;而UFM1-AMC能应用于基于荧光分析去犹素化酶的活性。同时,基于犹素激活酶UBA5催化的肼解反应,以重组表达的犹素快速合成了 UFM1Gly83-NHNH2,随后以氨解反应高效转化为包含异肽键结构的犹素荧光探针UFM1-Lys-TAMRA。进一步运用该前体,我们建立了犹素修饰组蛋白的化学合成方法,并证明能应用于犹素修饰核小体的组装和生化分析。研究结论:我们建立了犹素探针及犹素修饰蛋白的化学合成新方法。以高效合成的犹素酰肼UFM1Va182-NHNH2和UFM1Gly83-NHNH2作为通用模块,我们开发并获取了多种犹素探针,且首次实现犹素修饰组蛋白的化学合成。这些合成蛋白随后被证明具有正确的活性,如犹素探针能特异性共价捕获去犹素化酶或实时监测去犹素化酶的活性。我们的工作不仅为犹素修饰的识别和催化机制研究提供必要的蛋白分子,而且为去犹素化酶的鉴定和抑制剂发现创造了独特的分子工具。