论文部分内容阅读
白粉病是一类对植物生长、价值造成重大影响的植物病害,其中芍药白粉病直接影响到芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的观赏性和生产。目前我国针对芍药白粉病的基础研究仍然较少,尤其是生物学特性、芍药白粉菌的侵染过程与寄主的生理应答以及对叶际微生物群落影响、芍药感病前后转录组等方面的研究。本研究首先观察芍药白粉菌的显微结构,研究其分生孢子在不同介质（清水、琼脂、Parafilm膜和叶片）上的生长发育情况;显微观察发现有寄生孢在芍药白粉菌上寄生,经分离纯化得到白粉菌寄生孢AQ419菌株,对其初步进行了培养观察与分子生物学的系统进化关系研究;系统测定了受白粉菌侵染前后寄主生理应答反应,利用Illumina Novaseq高通量测序技术探究受到白粉菌侵染后芍药叶际微生物群落的变化,结合叶片相关生理指标与叶际微生物多样性进行互作的相关性分析;最后对受白粉病菌侵染前后叶片的转录组进行了测定与分析,探究关键基因与病原之间互作的关系。论文研究获得以下主要结果:1.经显微观察芍药白粉病病原菌分生孢子梗直立,分生孢子单生,椭圆形,无纤维体蛋白;闭囊壳聚生,球形;附属丝呈丝状扭曲、形状极不规则,多有分枝,无隔膜,顶端多屈膝状;子囊卵形或椭球形,含3-5个子囊孢子;子囊孢子卵形或长椭球形。初步鉴定芍药白粉病的病原菌为芍药白粉菌Erysiphe paeoniae。2.分生孢子在不同介质上萌发实验表明,芍药白粉菌分生孢子在Parafilm膜上萌发生长最好,6h左右在两端分别产生芽管,8h左右附着孢叉状且形成较长的初生菌丝,12h后萌发率高达73%。3.采用CTAB法提取芍药白粉病病原菌及其寄生孢总基因组DNA,PCR扩增r DNA内转录间隔区（ITS）的保守序列并测序,通过Clustal与MEAG软件构建系统发育树推演系统进化关系,结果表明芍药白粉病菌2020-88A为Erysiphe paeoniae,与日本AB257438.1菌株碱基相似度达99.99%,具有极近的亲缘关系;芍药白粉菌寄生孢AQ419与意大利欧洲种葡萄的葡萄白粉菌上的白粉寄生孢Amypelomyces quisqualis（HQ108046、HQ108047及HQ108048）碱基相似度达到99%,具有较近的亲缘关系。4.系统测定了芍药叶片受白粉菌侵染时抗氧化酶系统生理应答响应指标。测定结果显示芍药受到白粉菌侵染后,叶片CAT活性和POD活性在总体变化趋势上都是先升后降,其中POD含量最大值为33.6555 U/mgprot,最小值为25.0873 U/mgprot;CAT含量最大值12.1920 U/mgprot,最小值为6.3964 U/mgprot。叶片内SOD活性总体变化趋势为缓慢下降,SOD含量最低时为13.9718U/mgprot。叶片中的MDA活性在总体变化上呈现显著升高趋势,MDA含量最高时为7.9507 nmol/mgprot。5.高通量测序结果表明随着病害等级提高,叶际菌物群落中白粉菌属的相对丰度也逐渐升高,感病后白粉菌属的相对丰度由6.32%提升至63.60%,而其他物种的相对丰度逐渐降低,甚至逐渐趋于0。证明由于白粉病病害程度的加重,白粉菌会挤占其他菌物生存空间,使叶际菌物群落结构在白粉病发生时受到影响。叶际细菌微生物随着病害等级变化,细菌属水平上的各物种相对丰度差异相对较小,如uncultured＿bacterium＿f＿Lachnospiraceae的相对丰度由11.04%降至5.59%。由此发现,白粉菌的侵染对叶际菌物群落和叶际细菌群落造成的影响不同。叶际细菌群落结构直到白粉病发病十分严重时才会受到明显影响,并且叶际菌物群落结构受到的影响要远高于叶际细菌群落结构。6.针对病原与叶片及叶际微生物互作的更进一步分析结果表明,青霉菌和曲霉菌不仅与白粉菌具有显著相关性,更与各项抗氧化酶系统生理指标具有显著正向相关性,因此青霉菌和曲霉菌有可能成为对抗逆境的有益菌株,这将为芍药白粉病的防治提供新的参考。另外随着发病等级的提高,芍药白粉菌寄生孢的平均相对丰度也逐渐升高,由1.61142E-06升高至0.000785551,与发病严重程度呈正相关性,因此芍药白粉菌寄生孢的研究将有望开发成为白粉病防治的新型生物农药。7.对芍药叶片感病前后转录组测序与分析,GO富集分析结果显示在鉴定出来的1187个（上调726个,下调461个）差异基因中,上调的差异基因出现在ATPdependent chromatin remodeler activity（GO:0140658）、Cytosolic small ribosomal subunit（GO:0022627）、Fatty acid biosynthetic process（GO:0006633）和核糖体小亚基（GO:0015935）等功能区,而下调的差异基因出现在过氧化氢反应（GO:0042542）、蛋白质寡聚化（GO:0051259）、蛋白质自聚集（GO:0043621）和活性氧物种反应（GO:0000302）等功能区。KEGG Pathway富集分析显示鉴定出来的1187个差异基因中,上调的726个基因显著富集在亚油酸代谢（ko00591）、倍半萜类和三萜类生物合成（ko00909）和核糖体（ko03010）上;下调的461个基因显著富集在内质网蛋白加工通路（ko04141）上。同时筛选得到关于植物病原相互作用（Plant-pathogen interaction）通路中差异基因12个。8.在芍药叶片感病前后差异基因表达量筛选中发现基因TRINITY＿DN25448＿c0＿g2（K01373）在芍药叶片感病前后表达量差异最显著,上调差异表达倍数为46.704,该基因参与植物-病原互作通路,基因序列分析发现该基因为半胱氨酸蛋白酶相关基因,因此基因TRINITY＿DN25448＿c0＿g2可能是芍药响应相应生物胁迫的关键基因之一。