卵巢癌的死亡率高居妇女癌症死亡率的前五位,并居妇科恶性肿瘤的首位。大多数卵巢癌患者在诊断时已处于晚期,而晚期卵巢癌的治疗一直是一个很棘手的问题。尽管手术的改进、新药物的上市、新化疗方案的推出在一定程度上提高治疗效果,但5年生存率仍未见明显提高。化疗是晚期卵巢癌治疗的重要手段,但是多数晚期患者在治疗后复发或耐药,导致治疗失败。因此,有必要从卵巢癌发生发展机制和所处的激素环境出发,探寻新的治疗手段。我们课题组的前期工作表明,基于卵巢癌生理病理特征,以及卵巢组织所处的激素环境选择特定的靶向位点,有可能获得更为高效的治疗效果和更低的毒副反应。卵巢是下丘脑-垂体激素的靶器官,因此,由这些激素受体介导的靶向药物,相较其他靶标,在卵巢癌治疗中可能更具优势。其中,卵泡刺激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)在人体中的分布比较局限,大多集中在生殖系统,而且在人卵巢癌组织中亦有50%到60%的表达。我们课题组的前期研究表明,FSHR结合片段对纳米材料的修饰能够有效提高其对所包载的化疗药物或基因药物的特异性递送能力,FSHR是一种较为适宜的卵巢癌治疗靶位点。MUC16是CA125的编码基因,在卵巢癌组织和细胞中呈高表达,基于CA125在卵巢癌中的高表达,我们考虑可以利用CA125的编码基因MUC16的启动子作为第二重靶向,来指导靶向系统中目的基因在卵巢癌细胞中的表达。结合我们课题组前期研究,可以将MUC16启动子引入shRNA质粒,来调控质粒中shRNA的表达,从而特异性下调MUC16阳性卵巢癌细胞中目的基因的表达。同时,在包载质粒的纳米材料表面修饰以FSHR结合片段,通过FSHR受体介导的靶向和MUC16启动子的调控实现双重靶向。因此,本文选择FSHR的多肽结合片段作为靶向头基,构建主动靶向卵巢癌的递药系统。为了进一步提高靶向性,在递药系统中引入了MUC16启动子对下游基因进行调控。现在认为,对于肿瘤细胞,基质除了单纯的支持和营养作用以外,还参与了肿瘤的发生、发展以及转移。其中,成纤维细胞作为基质的主要成分,在癌变细胞和基质细胞的交互作用中扮演了主要角色。也已证实,肿瘤基质中的成纤维细胞在形态和功能上均不同于正常基质,它能够促进细胞的恶性转化,且与肿瘤的增殖、浸润和转移密切相关。本课题组在前期工作中也证实约83%的人卵巢癌组织中存在gro-a的高表达。因此,抑制gro-a表达或拮抗其功能的策略,不失成为干预肿瘤基质的有效策略。而干预肿瘤基质和抑制肿瘤细胞的双管齐下,定可提高抗肿瘤疗效。生长调节性癌基因a (Growth-regulated oncogene alpha, Gro-a)是细胞恶性转化过程中的关键元件,在卵巢癌组织与细胞中高表达,与卵巢癌的增殖,浸润及转移密切相关。为了对我们所构建的递药系统进行验证,选择gro-a的shRNA作为模型药物,对靶向复合物的体内外疗效进行考察。在第一部分中,我们采用免疫细胞化学、Western Blot、ELISA和实时定量PCR检测人卵巢癌细胞中FSHR、MUC16及gro-a的表达。结果提示人卵巢癌细胞系HEY高表达FSHR、MUC16及gro-a,因此我们将HEY细胞用于后续实验。而人卵巢癌细胞SKOV3低表达或不表达FSHR,同时又表达MUC16及Gro-a,因此我们将SKOV3细胞用作实验对照。在第二部分中,设计合成4条针对gro-a基因的shRNA序列,采用流式细胞仪及荧光显微镜检测不同序列对人卵巢癌细胞的转染效率。采用ELISA、 Western Blot口实时定量PCR检测不同序列对目的基因的下调情况,筛选出高效的gro-a shRNA序列。结果提示shRNA序列4较其他序列具有更强的沉默效果,因此我们选用此序列进行后续实验。在第三部分中,通过生物信息学方法预测得到4条可能有效的MUC16启动子序列,然后采用双荧光报告基因的方法对其进行启动子活性检测,获得活性较好的序列,并构建MUC16启动子调控的gro-a shRNA质粒。结果提示,启动子序列1和2在MUC16阳性的人卵巢癌细胞系HEY中具有较高的启动活性,因此我们将这2条序列用于质粒构建。在第四部分中,采用α-琥珀酰亚胺基-ω-丙基马来酰亚胺基-聚乙二醇和支链状聚乙烯亚胺制备不同配比的复合物,修饰以FSHR结合片段,并与有或无MUC16启动子调控的质粒DNA连接,制备靶向复合物。采用电镜、1H-NMR、粒径/Zeta电位仪和凝胶阻滞电泳实验对纳米复合物进行表征检测。结果显示,随着N/P比的增大,粒径逐渐缩小,Zeta电位也由负电荷向正电荷增加。当N/P比为10时,即可达到100%包封。当N/P比为25时,2%PEG接枝量的靶向复合物粒径约为(142.0±3.8)nm,Zeta电位约为(24.1±2.4)mV；非靶向复合物粒径约为(123.8±6.0)nm,Zeta电位约为(37.7±3.6)mV; 5%PEG接枝量的靶向复合物粒径约为(168.0±4)nm,Zeta电位约为(25.1±3.4)mV；非靶向复合物粒径约为(125.0±4.5)nm,Zeta电位约为(35.7±4.6) mV; FSH多肽修饰MUC16启动子调控的双靶向复合物粒径约为(186.0±4.5)nm；Zeta电位约为(30.0±2.3)mV；非FSH多肽修饰的MUC16启动子调控的双靶向复合物粒径约为(170.0±4.1)nm,Zeta电位为(33.0±3.3)mV。在第五部分中,采用ELISA、Western Blot和实时定量PCR检测靶向复合物对目的基因gro-a的下调效果,考察其靶向性。结果表明,PEG接枝量为2%或5%时,FSHR结合片段修饰的纳米复合物均可显著下调FSHR阳性卵巢癌细胞中gro-a的表达。当在递药系统中引入MUC16启动子调控后,gro-a在MUC16阳性卵巢癌细胞中的表达同样能够被下调。提示FSHR介导的靶向或是MUC16启动子调控的靶向均能够增强递药系统所携带的shRNA对细胞中目的基因的下调效应,可能是由于靶向基团在纳米材料的基础上进一步促进了药物进入细胞的能力所致。在第六部分中,采用细胞增殖实验以及transwell穿膜实验检测靶向复合物对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响。结果提示,FSH多肽修饰的纳米复合物能够明显抑制FSHR阳性的卵巢癌细胞HEY的增殖、侵袭和迁移能力。当引入MUC16启动子调控作为第二重靶向后,纳米复合物对细胞恶性生物学行为的抑制效应明显增强,其中以MUC16启动子序列1更为明显。此外,本部分结果提示FSH多肽修饰可在PEG的基础上一步降低纳米复合物自身的毒性,增加了体内应用的可行性。在第七部分中,利用人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,对靶向复合物的体内药效和安全性进行了初步评价。结果表明,有FSH多肽修饰的2%PEG接枝量靶向复合物能够明显抑制肿瘤生长,同时延长荷瘤裸鼠的生存时间,而无FSH多肽修饰的复合物在给药后第二天,70%的荷瘤裸鼠因急性毒性而死亡。将PEG的比例提升到5%后,各组裸鼠未出现明显的毒副反应。与其他组相比,FSH多肽修饰的靶向复合物对裸鼠瘤体生长的抑制作用最强,抑瘤率约为75.28%。实验结束后对荷瘤裸鼠的瘤体进行检测,结果提示FSH多肽修饰的纳米复合物能够下调肿瘤组织中目的基因gro-a mRNA及蛋白的表达水平。本文研制了FSH多肽修饰的靶向递药系统,并进行了配比优化,同时在此基础上引入了MUC16启动子作为第二重靶向调控。为了评价递药系统的作用价值,选择在卵巢癌细胞和基质细胞的交互对话中有重要作用的gro-a的小干扰RNA作为模型药物,考察靶向复合药物的疗效。FSH多肽修饰的靶向递药系统,当靶向沉默在卵巢癌细胞和基质细胞的交互对话中有重要作用的gro-a后,卵巢癌的生长受到显著抑制。同时,本研究结果提示,FSHR介导的主动靶向修饰能够降低纳米材料的毒性,增加了将其用于体内实验研究的可行性。这一研究再次证实我们提出的基于妇科肿瘤病理生理特点,筛选药物导向靶点,以此建立高效靶向治疗技术的思路是正确的,并为其他肿瘤的靶向治疗研究提供了可借鉴的方法。