背景和目的原发性肝细胞癌(HCC)是世界三大癌症相关死亡之一,是最常见的预后较差的肝脏恶性肿瘤。目前研究者建立了各种肿瘤异种移植模型用于人肝癌生物学和化疗研究,但由于其采用的模型动物主要是免疫缺陷鼠或诱导免疫耐受鼠,致使以此模型进行肿瘤免疫治疗的研究受到限制。因而构建免疫力正常的异种肿瘤移植模型,研究肿瘤与宿主的相互作用将有助于我们更好地理解肿瘤的免疫治疗。然而早先的研究证实肿瘤异种移植物仅可以生长于一些免疫豁免位点,如大鼠的颊囊、眼前房,或环孢霉素A处理的小鼠或大鼠的肾囊下生长。异种肿瘤移植物在免疫力正常宿主体内成功存活的主要障碍被认为是T细胞介导的免疫排斥及组织微环境。T细胞介导的异种免疫排斥的重要性已在裸鼠模型中得到证实,而异种肿瘤移植物与组织微环境的关系研究较少。肝脏作为人肝癌细胞移植的常见位点,近年被公认为一个复杂的免疫与耐受器官。它富含天然免疫细胞,如NK、NKT、枯否细胞和树突状细胞,尤其是NKT细胞,近年被称为免疫系统的瑞士军刀,其活化后可激活各类免疫细胞参与多种免疫反应。此外,经典CD4~+T和CD8~+T细胞在肝脏中的比例也与外周血相反。所有这些天然免疫和获得性免疫细胞决定着肝脏微环境的肿瘤监视,但它们在肿瘤异种移植物存活中所扮演的角色却知之甚少。本研究尝试在免疫力正常的乳鼠肝脏内移植入人的肝癌细胞来建立人肝癌—小鼠动物研究模型。其理论依据为:①乳鼠(约出生后0～15d)肝内高表达的甲胎蛋白(alpha-fetaprotein,AFP)具有抑制机体抗肿瘤免疫的生物学特性;②乳鼠胸腺尚未发育成熟,外周免疫系统尚未完善,免疫排斥较弱;③选择“免疫特赦器官”—肝脏作为荷瘤器官,易于诱导免疫耐受。在前期的实验中,我们首次将人肝癌细胞HepG2细胞原位移植到具正常免疫力的昆明种乳鼠肝内,构建了人肝癌HepG2移植性小鼠模型。虽然我们证实在免疫力正常的乳鼠肝内移植人HepG2细胞较成鼠成功率高,移植瘤细胞存活时间较长,但是随着乳鼠发育免疫系统的逐渐完善,肝内异种免疫排斥反应增强,肿瘤细胞在移植后7～9天开始坏死。肿瘤细胞在乳鼠肝内遭遇免疫排斥,何种免疫细胞参与了这一过程?肿瘤细胞在肝内被清除,肝内的免疫微环境发生了怎样的变化?尤其是数量丰富的NKT细胞的活化和功能有着怎样的改变?分化程度不同的异种肿瘤细胞,在乳鼠肝内的命运是否一样?CsA免疫抑制的荷瘤乳鼠肿瘤组织病理切片中并未发现淋巴细胞的浸润和肿瘤细胞的坏死,其对细胞介导的异种免疫排斥有着怎样的影响?围绕这些问题,本研究将生长特性不同的人肝癌细胞株(HepG2和HCCLM3)移植到免疫力正常的乳鼠体内,探讨人肝癌细胞在乳鼠肝内的存活情况、肝内细胞介导的免疫排斥反应、NKT细胞活化及功能的改变。为更好地阐明这一点,我们同时采用成鼠及低剂量CsA处理的乳鼠和成鼠做移植受体,进行对比研究。本研究为HCC异种模型的建立提供了一种新的尝试,为NKT细胞介导的肿瘤异种排斥呈现了一个新的视角。而且它有助于更好地了解CsA的免疫抑制机制,无论是在临床还是动物模型的研究中。研究方法1、DMAHAS体外标记细胞与细胞毒性分析1)DMAHAS标记人肝癌HepG2细胞并荧光成像;2)DMAHAS标记细胞荧光释放分析;3)MTT和中性红法检测DMAHAS处理HepG2细胞的活力;4)考马斯亮蓝法测定细胞总蛋白;5)PI流式细胞术检测细胞周期与凋亡;2、乳鼠和成鼠人肝癌原位移植1)肿瘤细胞培养与体外DMAHAS标记;2)低剂量CsA(10 mg/kg)处理小鼠及其血清浓度检测;3)人肝癌细胞小鼠肝内原位移植;4)异种移植物组织冰冻切片分析及荧光成像;5)异种移植物组织常规HE染色及病理分析;3、荷瘤乳鼠及成鼠不同细胞免疫排斥机理的研究1)人肝癌细胞HCCLM3小鼠肝内原位移植;2)低剂量CsA(10 mg/kg)小鼠皮下注射;3)小鼠肝脾淋巴细胞分离和计数;4)DMAHAS荧光释放法检测CTL杀伤活性;5)荷瘤乳鼠血清肿瘤细胞特异性抗体检测;6)荷瘤小鼠肝脾淋巴细胞流式细胞术免疫表型分析;4、荷瘤小鼠NKT细胞活化及功能的研究1)人肝癌细胞HCCLM3小鼠肝内原位移植;2)低剂量CsA(10 mg/kg)小鼠皮下注射;3)分离小鼠肝脾淋巴细胞并计数;4)乳酸脱氢酶释放法检测NKT细胞杀伤活性;5)肝脾淋巴细胞NKT活化与CD1d表达分析;6)血清及肝脏组织IL-4和IFN-γELISA定量检测;7)体外免疫细胞特异性清除;8)LDH释放法测定CTL活性。研究结果第一部分DMAHAS体外标记细胞成像DMAHAS可在30分钟内快速标记活细胞或多聚甲醛固定的细胞,最适工作浓度为5μM。DMAHAS定位于细胞质,当受到紫外或长波长光(800nm)激发时,可自发地发射蓝色荧光。DMAHAS体外标记细胞与细胞毒性分析采用工作浓度5μM的DMAHAS标记HepG2细胞培养24小时进行MTT、NR、CB和PI流式细胞术检测表明DMAHAS对标记细胞无显著影响(P＞0.05)。DMAHAS标记肿瘤细胞体内示踪和荧光成像DMAHAS标记的人肝癌HepG2和HCCLM3细胞可在受体鼠肝内存活4周以上,移植肿瘤细胞随时间延长逐渐减少,在移植后六周受体鼠肝内未检测到肿瘤细胞或荧光信号。而且检测过程中未见DMAHAS荧光信号的衰减。乳鼠肝脏移植瘤组织病理分析人肝癌HCCLM3细胞原位移植于乳鼠肝内后,第8天左右肝内正常组织出现淋巴细胞的募集,移植瘤周围出现淋巴细胞浸润,无明显的炎性细胞如中性粒细胞或巨噬细胞介入。部分肿瘤移植物仍可存活4周以上,未见明显的肝内转移。低剂量CsA处理可有效减少淋巴细胞浸润,延长肿瘤细胞存活期至5周以上。第二部分荷瘤小鼠肝脾淋巴细胞变化荷瘤乳鼠肝脏淋巴细胞数量于移植后的10天和16天增加(P＜0.05),同时脾脏淋巴细胞数量减少,同样的结果可见于移植后4天、8天和10天的成鼠。并且荷瘤小鼠脾脏或肝脏淋巴细胞未见明显凋亡。荷瘤小鼠肝脾淋巴细胞免疫分析移植后第16天,乳鼠肝脏CD4~+T细胞绝对计数和百分比显著增加(P＜0.01),NK和CD8~+T细胞数量绝对计数在肝脏内增加,而在脾脏中减少(P＜0.05)。成鼠于移植后2天即见CD8~+T细胞在肝内的增加与脾内的减少。荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞杀伤功能检测荷瘤16天的乳鼠脾脏淋巴细胞在10:1,20:1和50:1效靶比时对HCCLM3细胞的杀伤显著增加(P＜0.05)。低剂量CsA对移植瘤存活及其引发的免疫反应的影响低剂量CsA处理可显著地减少乳鼠肝内淋巴细胞侵润,延长肿瘤移植物存活期至5周以上。然而其对移植物在成鼠肝内的存活无明显影响。除对CD4~+和CD8~+细胞有抑制效果外,低剂量CsA可有效地抑制NKT细胞的活化。此外,低剂量CsA处理可有效抑制荷瘤乳鼠脾脏效应细胞的功能。第三部分HCCLM3异种移植物诱导的肝脏NKT细胞活化HCCLM3移植于3日龄乳鼠肝内后,其肝脏NKT细胞NK1.1分子在移植后5天和10天表达丢失。16天时表达增加并伴随NKT细胞活性增强。成鼠在移植后2天和4天可见NK1.1分子的大量丢失,并于10天时恢复至正常水平。脾脏NK/NKT细胞表面NK1.1分子的表达在移植前后无显著变化。荷瘤小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞CD1d表达乳鼠在移植后10天时肝脏NK1.1~+细胞表面CD1d的表达开始增加,随后CD1d的表达上调可见于移植后16天和28天肝脏CD3~+T和NK1.1~+细胞。类似的结果可见于移植后4天和10天时的成鼠肝脾淋巴细胞。荷瘤小鼠血清IL-4和IFN-γ检测血清取自荷瘤10天和16天的乳鼠或4天和8天的成鼠。IFN-γ的水平在移植后的乳鼠和成鼠血清中均有增加(P＜0.05),而IL-4水平的升高仅见于移植后10天的乳鼠和4天的成鼠血清(P＜0.05)。低剂量CsA对NKT细胞活化和功能的影响低剂量CsA处理可显著抑制荷瘤乳鼠肝脏NKT细胞的功能(P＜0.05)及移植2天时的成鼠NKT细胞活化。此外低剂量CsA可显著抑制受体鼠血清IL-4和IFN-γ的分泌,而并未显著下调肝脾T细胞或NK1.1~+T细胞表面CD1d的表达。荷瘤乳鼠淋巴细胞体外免疫清除CTL活性分析体外特异性清除荷瘤乳鼠淋巴细胞中的CD3或CD8细胞,可显著降低CTL细胞的杀伤活性(P＜0.05);而特异性清除CD4或NK1.1~+细胞却无明显影响。研究结论1.首次应用新型双光子荧光染料DMAHAS标记人肝癌细胞及荧光成像研究,并初次证实其对标记细胞的活力、总蛋白合成和细胞周期与凋亡无显著影响。体内研究表明DMAHAS可作为一种安全可靠的探针用于肿瘤细胞示踪和荧光成像研究。2.初步证实乳鼠肝脏较成鼠肝脏更适宜于异种肿瘤细胞的存活与生长。3.淋巴细胞在荷瘤小鼠脾脏中的减少及肝脏中的增加暗示脾脏淋巴细胞以某种方式参与了肝脏异种肿瘤移植物的免疫排斥反应。4.乳鼠和成鼠肝内发生了对肿瘤移植物不同的细胞免疫排斥反应。参与乳鼠肿瘤延迟排斥反应的免疫细胞主要是CD4~+T、NK1.1~+细胞及CD8~+T细胞,而参与成鼠肿瘤急性排斥反应的免疫细胞主要是CD8~+T细胞、NK1.1~+细胞及大量的炎性细胞,如中性粒细胞或巨噬细胞。5.肝脏NKT细胞在异种肿瘤的排斥反应早期活化、功能及活性增强,表明其在排斥反应的早期起着重要作用。6.CD1d分子在荷瘤小鼠肝脏淋巴细胞不同时期表达的增加,表明其参与了异种肿瘤抗原的免疫呈递过程及异种移植物的免疫清除。7.低剂量CsA处理可显著地抑制乳鼠的免疫排斥反应,延长肿瘤移植物存活期,然而其对成鼠肝内肿瘤移植物存活无明显影响。8.除对CD4~+和CD8~+T细胞功能有抑制作用外,低剂量CsA可有效抑制肝脏NKT细胞的活化及功能,而且这种抑制方式可能不依赖于CD1d。