研究背景:胃癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一,由于较高的发病率与死亡率,其已经成为目前威胁我国人民生命与健康的严重问题。根治性R0手术切除与充分的淋巴结清扫是目前唯一可能使胃癌达到治愈的治疗手段。然而,由于早期缺乏明显的临床症状及阳性体征,多数病人在确诊为胃癌时以处于疾病的进展期,大大影响了病人的治疗效果。另一方面,即便接受了根治性手术,仍然有很大一部分病人在术后短期内出现了肿瘤的复发与转移,这使得胃癌病人预后依然无法令人满意。尽管传统的肿瘤标志物检测,如血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原CA19-9、糖类抗原CA125等已广泛应用于临床,但对于胃癌的诊断而言仍缺乏足够的特异性与敏感性。因此,寻找新的、更为敏感的诊断标志物与预后分子,对于提高胃癌早期诊断的成功率、监测肿瘤的复发与转移,揭示胃癌发生发展涉及的分子机制具有非常重要的意义。细胞分裂周期蛋白6(Cell division cycle 6,CDC6)位于人类染色体17q21.3,是真核细胞DNA复制起始必需的调控蛋白。研究发现CDC6的主要功能是参与DNA复制前复合体(pre-replication complex,pre-RC)的组装,并影响细胞周期检测点的激活,调控细胞由G1期向S期过渡并完成有丝分裂过程。由此可见,CDC6的异常表达可以对DNA复制、基因组稳定性的保持及细胞增殖等过程产生极为严重的后果,并最终导致肿瘤的发生与恶性转变。目前已有研究证实CDC6在上皮卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌及胆囊癌等多种恶性肿瘤组织中存在明显异常高表达。然而,目前尚没有关于CDC6在胃癌组织中表达及其临床意义的相关报道,CDC6是否能够影响胃癌细胞的增殖、侵袭等生物学行为仍需要进一步研究及验证。此外,CDC6在肿瘤组织中异常表达的具体机制也尚不清楚。MicroRNAs(miRNAs)是近年来发现的一类广泛存在于真核细胞内的长度为19-25个核苷酸构成的非编码小分子RNA。之前的研究已发现其可以通过与靶基因mRNA 3’非翻译区(3’UTR,untraslated regions)的一段特定互补序列结合引起mRNA降解或翻译抑制,从而在转录后水平负向调控下游靶基因的表达。miR-26b是miR-26家族中的一员,现已证实其可以通过调控不同靶基因的表达在多种肿瘤的发生发展中扮演抑癌基因或促癌基因的角色。一些研究表明上调miR-26b的表达能够明显抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力。相反,其他研究则展示miR-26b表达的上调赋予肿瘤细胞恶性表型,明显增加了肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移等能力。然而,目前很少有关于miR-26b在胃癌中表达情况的报道。寻找与肿瘤发生发展相关的分子标志,明确其分子调控网络,对于胃癌的早期诊断与治疗具有极为重要的意义。我们希望能够通过本研究为胃癌的靶向治疗与分子病理机制的理解提供一些新的证据与认识。研究目的:本研究旨在探索miR-26b与CDC6在胃癌中的表达及其临床意义,研究miR-26b与CDC6表达对胃癌细胞生物学功能的影响,揭示二者在胃癌组织及细胞中的表达调控关系,并进一步明确miR-26b对胃癌细胞增殖、侵袭能力的作用是否与调控CDC6的表达有关。研究方法:本研究收集了48例于2016年间在中国医科大学第一附属医院胃肠肿瘤外科接受胃癌根治性切除术的病人的胃癌组织及癌旁组织标本。我们通过qRT-PCR检测miR-26b在48对胃癌组织及对应癌旁组织中的表达情况,分析miR-26b表达与胃癌病人临床病理资料之间的关系。此外,本研究还收集了50例在同一时期内于我院接受胃癌根治性手术的胃癌病人的石蜡切片标本。利用免疫组化染色的方法检测了CDC6在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况,并通过回顾病人的临床病理资料,分析了其与CDC6在胃癌组织中表达的关系。我们也通过Spearman相关分析评估了miR-26b与CDC6在胃癌组织中表达的相关性。此外,我们以人正常胃上皮细胞GES1为参照,通过qPCR分别检测了miR-26b与CDC6在胃癌细胞系MGC-803、BCG823及SGC7901中的表达情况,分析了二者在胃癌细胞中的表达关系。接下来,我们进行了细胞功能实验进一步研究miR-26b与CDC6表达对胃癌细胞生物学行为的影响。合成的miR-26b类似物用来外源性提升miR-26b在胃癌细胞系中的表达水平,同时我们也构建了含有特定干扰序列的RNA(siRNA)载体用以沉默CDC6在胃癌细胞中的表达。转染miR-26b类似物或含有CDC6的RNA特定干扰序列后,我们通过qPCR与Western Blot对过表达或干扰效果进行验证。通过MTS实验,我们分别评估了上调miR-26b表达与CDC6表达沉默对胃癌细胞SGC7901体外生长能力的影响。通过Transwell试验检测了miR-26b与CDC6表达对胃癌细胞侵袭能力的影响。此外,我们还通过AnnexinV-PI染色,在流式细胞仪上检测了上调miR-26b表达与CDC6表达沉默对细胞凋亡的影响。通过搜索Target-Scan、miRanda和miRBase等生物信息学数据库,我们对miR-26b调控的潜在靶基因进行初步地分析与预测。针对预测位点,我们分别构建了含有miR-26b结合位点的野生型CDC6 3’UTR片段序列及相应的突变序列。为了明确miR-26b对CDC6表达的靶向调控作用,我们继续通过荧光素酶报告基因实验检测了miR-26b在CDC6 3’UTR的结合活性。此外,研究还通过Western Blot检测了miR-26b对CDC6在蛋白水平表达调控的影响。最后,为了进一步证实CDC6作为靶基因参与了miR-26b对胃癌细胞增殖、侵袭等生物学行为的调控作用,我们在转染miR-26b类似物的胃癌细胞中重新恢复CDC6的表达,再次通过MTS实验与Transwell实验检测了其对胃癌细胞增殖、侵袭能力的影响。研究结果:与癌旁组织相比,miR-26b在胃癌组织中的表达水平明显减低(P<0.05),miR-26b的低表达与肿瘤的浆膜浸润(P<0.05)及病理分期显著相关(P<0.05)。相反,CDC6在胃癌组织中主要表达于细胞浆与细胞核中,其在胃癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织(62%vs 24%,P<0.05)。CDC6在胃癌组织中的高表达明显与淋巴结转移(P<0.05)、生长浸润类型(P<0.05)及淋巴血管浸润(P<0.05)有关。Spearman相关分析表明在胃癌组织中miR-26b与CDC6的表达呈明显负相关(r=-0.591,P<0.01)。同样,与人正常胃上皮细胞GES1相比,miR-26b在胃癌细胞MGC-803、BCG823及SGC7901中表达明显下调(P<0.05),而CDC6在3株胃癌细胞系中表达明显上调(P<0.05)。这一结果与两者在胃癌组织中的表达关系一致。转染miR-26b类似物能够明显上调miR-26b在胃癌细胞SGC7901中的表达(P<0.05)。与对照组细胞相比(AgomiR-NC),转染miR-26b类似物后的SGC7901细胞增殖能力明显受到抑制(P<0.05),而发生细胞凋亡的比例明显增加(2.8±0.2%vs 6.5±0.5%,P<0.05)。Transwell实验表明外源性上调miR-26b的表达明显减少了穿透基质膜的胃癌细胞数量(AgomiR-NC组:98.7±5.5 vs AgomiR-26b组:68.3±7.1,P<0.01)。另一方面,Western Blot的结果表明转染含有CDC6特定干扰序列的载体后,CDC6在胃癌细胞SGC7901中的表达水平明显降低。MTS实验和细胞凋亡实验分别表明干扰沉默CDC6的表达同样可以有效地抑制SGC7901细胞的生长(P<0.05),促进细胞凋亡的发生(Si-CDC6组:8.0±0.4%vs Si-NC组:3.3±0.2%,P<0.05)。Transwell实验结果展示干扰沉默CDC6后,穿透基质膜的SGC7901细胞数为85.7±3.2,明显少于空白对照组(115.3±8.4)及Si-NC组(109.3±7.6),差异具有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明下调CDC6的表达能够明显抑制胃癌细胞的增殖、侵袭能力,这与上调miR-26b表达对胃癌细胞生物学行为的影响类似。更为重要的是,重新恢复CDC6的表达能够逆转miR-26b过表达对胃癌细胞增殖、侵袭能力的抑制作用。生物信息学分析的结果表明在CDC6 mRNA的3’UTR第109-116碱基之间存在一个与miR-26b特异结合的保守序列位点。此外,我们发现与对照组相比,过表达miR-26b明显抑制了内源性CDC6在蛋白水平的表达。荧光素酶报告实验证实过表达miR-26b能够明显降低野生型CDC6-3’UTR组的荧光素酶活性(P<0.05),但并不会对突变型CDC6-3’UTR组的荧光素酶活性产生明显的影响。结论:miR-26b与CDC6在胃癌组织及细胞中的表达呈明显负相关,上调miR-26b或抑制CDC6的表达均能明显抑制胃癌细胞的增殖、侵袭能力,二者或许共同参与了胃癌的发生发展过程。CDC6是miR-26b的一个靶基因,其表达受到miR-26b的负向调控,miR-26b对胃癌细胞生物学行为的影响至少部分是通过调控CDC6的表达而实现的。miR-26b与CDC6或许能够成为胃癌诊断与治疗新的潜在分子靶点。