致病性细菌污染引起的食物中毒是一个十分重要的公共卫生问题,其发生率占食源性疾病的首位,严重危害着人类健康。研究和发展新型、快速、灵敏、特异的致病菌检测技术,是微生物学检测技术发展的主要内容和必然趋势。本论文根据细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系的发光强度与其必需底物NADH的浓度在一定范围内呈正相关关系,借助噬菌体专一性裂解宿主菌原理,建立了一种检测水产品中致病菌的方法,即细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系与噬菌体联用的生物发光法快速检测致病菌的方法。该方法以胞内NADH为检测指标,使检测技术具有应用普遍性；检测体系中噬菌体的应用,使得检测方法具有特异性。应用该检测方法对水产品中的克雷伯氏菌、大肠杆菌进行了快速检测。第一,根据细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶催化生物发光的机理,通过优化体系中各底物的添加量,分别建立了细菌荧光素酶体外发光单酶体系和细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系。比较单、双酶体系的发光强度及稳定性,双酶体系发光强度高且稳定,更适合检测方面的应用。应用该体系定量检测]NADH, NADH的浓度与双酶体系的发光强度呈良好的线性关系,其线性范围为1×10-10～10-8 mol/L。双酶体系应用于定量检测NADH,为双酶体系进一步应用于活细菌数量的检测奠定了基础。第二,应用细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系进行致病菌的检测。为保证检测方法的特异性,方法中引进噬菌体,借助噬菌体专一性裂解宿主菌的原理提取目的菌胞内NADH。应用双酶体系测定NADH的量,即可确定不同菌数的细菌与双酶体系发光强度的关系。本论文通过优化分别建立了克雷伯氏菌和大肠杆菌两种致病菌的检测体系。应用细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系检测纯培养的两种致病菌,分别确立了不同菌数的纯培养的克雷伯氏菌、大肠杆菌与双酶体系发光强度的标准曲线。在不增菌的条件下,双酶体系检测两种致病菌的检测限为107cfu/mL数量级,克雷伯氏菌的检测过程可在0.5 hr内完成,大肠杆菌的检测过程可在1hr内完成。方法特异性验证结果良好。第三,应用细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系联合噬菌体裂解的方法检测了鲅鱼鱼肉中的克雷伯氏菌和大肠杆菌。在不增菌的条件下,双酶体系检测克雷伯氏菌污染样品的方法检出限为3.1×108 cfu/g,检测大肠杆菌污染样品的方法检出限分别为2.4×108 cfu/g。为满足实际检测的需要,对克雷伯氏菌、大肠杆菌的前增菌做了初步研究。初始浓度为100 cfu/g的克雷伯氏菌,在营养肉汤培养基中经过5 hr的增菌培养后应用双酶体系可以明显检测到；初始浓度为100 cfu/g的大肠杆菌,在营养肉汤培养基中增菌培养6 hr后应用双酶体系可以明显检测到。细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系联合噬菌体进行水产品中致病菌快速检测方法的建立,为今后双酶体系应用于检测水产品中多种致病菌搭建了较好的技术平台。第四,对细菌荧光素酶和1(?)MN:NADH氧化还原酶的共固定化进行了初步研究。以酶活回收率为指标,通过优化确立了海藻酸钠包埋法固定化双酶的条件。应用固定化双酶测定(?)ADH, NADH的检测限为1.0×10*9 mol/L。细菌荧光素酶和FMN:NADH氧化还原酶的共固定化的研究明确了双酶共固定化的可行性,为双酶共固定化的商业化开发前景提供科学理论依据。总之,本论文建立的细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系与噬菌体联用的生物发光法检测水产品中致病菌的方法是一种简便、灵敏、快速、特异性强的检测方法。