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目的:急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）是一组临床综合征,肾毒性药物、缺氧、缺血再灌注损伤、脓毒症、外伤及体液分布不平衡等原因都会引起肾组织的损伤与破坏并最终导致以少尿或无尿为特征的肾功能丧失。AKI造成肾功能和结构不完全修复,诱发肾纤维化,其发病率呈逐年增高的趋势。正常肾脏在经历了AKI之后,即使肾功能短期之内得到恢复,未来转变成慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）的风险也较未发生过AKI者明显升高。CKD是进行性发展的慢性疾病,多种细胞因子和环节参与其中,发病机制错综复杂,但肾脏纤维化是发展为CKD的必经环节,因此如何阻止AKI后肾纤维化,受到国内外学者越来越多的关注,这对于解决CKD的社会经济问题具有极其重要的意义。miR-101-3p（miR-101）水平被报道在AKI病人血清中显著上升,在AKI时发挥保护作用,但其能否减轻AKI后的肾纤维化还不明确。上皮间质转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）涉及到细胞形态的改变、极性的丧失及运动性的增强,EMT在肾纤维化过程中发挥重要作用,抑制EMT过程可有效缓解肾纤维化。通过生物信息学网站预测出COL10A1和TGFβR1与miR-101存在结合位点,且上述两种因子可促进EMT的发生,参与纤维化进程。我们推测miR-101可能通过靶向COL10A1、TGFβR1进而抑制EMT在AKI后肾纤维化中发挥保护作用。本研究目的在于明确miR-101在AKI后肾纤维化中的表达变化及作用,并阐明其具体的分子机制。本研究将从miR-101这个新视点揭示AKI后肾纤维化的生物学机制,可望成为今后预防AKI后肾脏慢性进展的新干预靶点之一。研究方法:第一部分,动物实验,造模并检测AKI后肾纤维化时miR-101表达变化情况、预测并验证下游靶基因:采用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠应用缺血再灌注（I/R）的方式建立AKI后肾脏纤维化的动物模型,C57BL/6小鼠平均分为两组:假手术组（Sham组）和模型组（I/R组）,各10只。I/R组采用左侧肾蒂结扎35 min（于38℃环境）再灌注,建立C57BL/6小鼠I/R模型,取材前一周（术后35天）切除对侧肾脏,42天后,处死小鼠,取血、取肾组织待测。Sham组小鼠接受除左侧肾蒂结扎外的所有手术操作。1应用HE染色检测肾组织形态变化;2 Masson染色检测肾组织中胶原形成情况;3酶法检测血清肌酐（Scr）,脲酶比色法检测血清尿素（BUN）水平;4 Real-time PCR检测肾组织中miR-101的表达;5生物信息学软件Targetscan预测能与miR-101结合的靶基因;6Real-time PCR检测肾组织中COL10A1和TGFβR1的表达;7 Western blot检测肾组织中COL10A1和TGFβR1的表达;8双荧光素酶报告基因验证miR-101与COL10A1、TGFβR1的靶向结合关系。第二部分,动物实验,上调miR-101对AKI后肾纤维化的影响及机制:制备miR-101过表达小鼠模型:包装miR-101过表达慢病毒颗粒LV-miR-101,空载慢病毒作为对照LV-NC,采用缺血再灌注方法制备C57BL/6小鼠AKI后肾纤维化模型,I/R后24h静脉注射一次LV-miR-101或LV-NC（1×109 TU/mL,150μL）。42天后处死小鼠,取肾组织待测。实验分组:I/R组,I/R+NC组,I/R+mmu-miR-101组,各12只。1 Real-time PCR检测三组miR-101表达水平;2 HE染色检测肾组织形态变化;3 Masson染色检测肾组织中胶原形成情况;4免疫荧光法检测肾组织中α-SMA和Collagen 1蛋白表达,并定量分析阳性表达面积;5 Real-time PCR检测肾组织中α-SMA的表达水平;6 Western blot检测肾组织中α-SMA蛋白水平;7 miR-101对AKI后肾纤维化小鼠EMT的影响;1)Western blot检测肾组织中E-cadherin,Vimentin蛋白水平;2)Real-time PCR检测肾组织中E-cadherin,Vimentin m RNA水平;8 miR-101对肾组织中COL10A1、TGFβR1表达的影响;1)Real-time PCR检测肾组织中COL10A1、TGFβBR1 mRNA水平;2)Western blot检测肾组织中COL10A1、TGFβR1蛋白水平。第三部分细胞实验,（一）miR-101对低氧诱导的HK-2细胞的影响:合成hsa-miR-101 mimics和对照NC mimics。体外培养HK-2人肾小管上皮细胞,分别转染人miR-101 mimics或NC。转染换液后,低氧的HK-2细胞培养在含氧量1%的培养箱中,常氧的HK-2细胞培养在含氧量21%的培养箱中,培养48 h后进行如下实验:实验分组:Normoxia,Hypoxia,Hypoxia+NC,Hypoxia+hsa-miR-101mimics。1 miR-101对低氧诱导的HK-2细胞EMT的影响:1)Real-time PCR检测细胞中miR-101表达水平;2)Western blot检测细胞中E-cadherin,Vimentin和α-SMA蛋白水平;3)免疫荧光实验检测E-cadherin,Vimentin的表达。2miR-101对HK-2细胞COL10A1、TGFβR1的影响:1)Real-time PCR检测细胞中COL10A1和TGFβR1 mRNA水平;2)Western blot检测细胞中COL10A1和TGFβR1蛋白水平。（二）COL10A1对低氧诱导的HK-2细胞EMT的影响:设计并化学合成人COL10A1 siRNA和对照NC siRNA。HK-2细胞转染人si-COL10A1或si-NC。转染换液后,低氧的HK-2细胞培养在含氧量1%的培养箱中,常氧的HK-2细胞培养在含氧量21%的培养箱中,培养48h后进行如下实验:实验分组:Normoxia,Hypoxia,Hypoxia+si-NC,Hypoxia+si-COL10A1。1 Western blot检测细胞中COL10A1、E-cadherin、Vimentin和α-SMA的蛋白水平;2 Real-time PCR检测细胞中COL10A1、E-cadherin、Vimentin和α-SMA mRNA水平。结果:第一部分:I/R损伤42天后,小鼠肾脏组织肾小管扩张,较多的炎性细胞浸润,部分上皮细胞萎缩塌陷,间质细胞及细胞外基质成分增多,肾小管间质和肾小球中胶原蛋白增加,出现多灶状纤维化表现,且肾脏纤维化过程中伴随有肾脏功能的损失。纤维化小鼠肾脏组织中miR-101的表达水平较Sham组下降。TargetScan网站预测出COL10A1和TGFβR1与miR-101存在结合位点,且COL10A1和TGFβR1的蛋白与mRNA水平在I/R组上调,与miR-101的变化趋势相反。最后应用双荧光素酶报告基因检测发现,较比miRNA空载对照组,miR-101可以明显下调野生组COL10A1和TGFβR1-3′UTR荧光素酶活性,却不能下调突变组COL10A1和TGFβR1-3′UTR荧光素酶活性,进而证明COL10A1、TGFβR1与miR-101存在直接结合关系。第二部分:1.上调miR-101可减轻AKI后肾纤维化进程。I/R+miR-101过表达慢病毒组小鼠肾脏组织中miR-101的表达上调;I/R组小鼠肾组织病理结果显示肾脏结构破坏,胶原含量增加,而过表达miR-101组,肾小管及肾小球结构清晰,基底膜完整,炎性细胞及胶原蛋白沉积减少,同时Collagen-1和α-SMA的免疫荧光染色阳性区域面积较I/R组减少,说明过表达miR-101可以减轻AKI后肾脏纤维化程度。2.上调miR-101减轻肾脏EMT。用α-SMA、E-cadherin和vimentin定量评价肾组织EMT程度。发现过表达miR-101使上皮细胞标志物E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平显著升高,而间质标志物vimentin和α-SMA的mRNA及蛋白表达水平降低。3.miR-101抑制COL10A1和TGFβR1的表达。过表达miR-101组COL10A1和TGFβR1 mRNA和蛋白表达较I/R及空载组明显减少。第三部分:1.miR-101减轻HK-2细胞EMT。低氧条件下（1%O2）HK-2细胞形态发生改变,不再表现为常氧（21%O2）时的卵圆形上皮样细胞形态,而是出现排列紊乱,间隙变宽,长梭样肌成纤维细胞外观改变。低氧组中miR-101表达较常氧组减少,过表达miR-101后miR-101表达量较空载组明显增高;HK-2细胞低氧时,间质标志物α-SMA和Vimentin表达水平较常氧组增加,而上皮标志物E-cadherin表达减少,提示低氧可以促进细胞EMT的发生;当过表达miR-101后α-SMA和Vimentin蛋白表达水平较空载对照组减少,而E-cadherin的表达增加,提示miR-101抑制HK-2细胞的EMT过程。2.miR-101可抑制其下游靶基因COL10A1和TGFβR1的表达。过表达miR-101组中COL10A1和TGFβR1的mRNA和蛋白水平均较对照组明显下调。3.下调COL10A1减轻HK-2细胞的EMT程度。体外转染si-COL10A,使HK-2细胞中COL10A1低表达,伴随有E-cadherin表达的增加和Vimentin、α-SMA水平的下降。结论:1、AKI后肾间质纤维化是肾脏不良修复慢性转归的重要病理表现;2、上调miR-101可减轻AKI后肾纤维化,并抑制COL10A1和TGFβR1的表达;3、miR-101抑制COL10A1和TGFβR1,减轻HK-2细胞EMT。且下调COL10A1能逆转HK-2细胞EMT。