【摘 要】
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目的1.基于生物信息学探寻ADHD（Attention Deficit Hyperactive Disorder,ADHD）患儿外周血差异表达miR-30d-5p在注意缺陷多动障碍的可能作用途径。2.观察ADHD模型SHR（Spontaneously Hypertensive Rat）大鼠及对照WKY（Wistar Kyoto）大鼠PFC中miR-30d-5p和BDNF表达水平的差异。3.外周循环
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目的1.基于生物信息学探寻ADHD（Attention Deficit Hyperactive Disorder,ADHD）患儿外周血差异表达miR-30d-5p在注意缺陷多动障碍的可能作用途径。2.观察ADHD模型SHR（Spontaneously Hypertensive Rat）大鼠及对照WKY（Wistar Kyoto）大鼠PFC中miR-30d-5p和BDNF表达水平的差异。3.外周循环差异表达的miR-30d-5p作用于BDNF（Brain–derived neurotrophic-factor）调控ADHD行为变化的研究。方法1.在前期的研究中本课题组发现miRNA在ADHD的发病机制中具有重要的作用,之后本课题组收集了20例ADHD患儿和60名健康对照儿童的血清样本,通过miRNA芯片筛选出了表达差异有统计学意义的miRNA,其中miR-30d-5p、miR-4655-3p和miR-7641,fold change﹥2倍,且经实时荧光定量PCR验证差异显著。2.通过生物信息网站中miRNA数据库对miR-30d-5p的靶基因进行预测,将各个miRNA数据库预测靶基因取交集后,使用生物信息学软件对miR-30-5p的靶基因进行GO富集和KEGG富集分析,并构建关键基因的蛋白互作网络（PPI）,进而筛选出前10位关键基因（hub gene）。3.通过ADHDgene数据库获取ADHD相关基因,基于miR-30d-5p靶基因的PPI构建ADHD相关基因的PPI,并与miR-30d-5p靶基因中的关键基因进行分析,找出其可能作用最大的靶基因。4.比较WKY和SHR大鼠PFC中miR-30d-5p和BDNF表达水平差异。取PFC脑组织,RT-q PCR（荧光定量聚合链式反应）检测miR-30d-5p的表达差异,同时分别在mRNA和蛋白水平检测BDNF的表达量。5.体外分别转染miR-30d-5p过表达质粒和腺相关病毒载体,收集细胞检测BDNF在mRNA和蛋白水平的表达变化。6.SHR大鼠PFC注射腺相关病毒miR-30d-5p载体,通过旷场实验和迷宫实验观察SHR大鼠ADHD样行为变化;取PFC脑组织,分别在mRNA和蛋白水平检测BDNF的表达量。结果:1.在Target Scan7.2数据库中获得miR-30d-5p预测靶基因1 579个,miRDB数据库中1539个,miRTar Base数据库中369个。取三个数据库的两两交集去掉重复后共有1 142个靶基因纳入研究。2.对筛选出的1142个靶基因进行GO功能富集分析显示:靶基因定位到核质、细胞内细胞器、轴突、细胞膜等细胞结构,并在神经系统中广泛参与到神经元的发育、分化、神经元发生的调节、神经元投射发育、顺式调控区结合及顺式调控区序列特异性DNA结合等生物学过程;KEGG信号通路富集显示:靶基因主要富集在Fox O信号通路、轴突导向、海马长时程增强和神经营养信号通路这4条通路中。3.通过生信相关软件构建miR-30d-5p靶基因蛋白的PPI,并筛选出了前10位关键基因:NOTCH1、KRAS、SIRT1、MAPK8、SOCS3、NEDD4、SKP2、BDNF、NEDD4L、SOCS1。4.与ADHDgene数据库中基因对比发现,靶基因中有33个基因与ADHD的发病机制相关。基于miR-30d-5p靶基因蛋白的PPI构建33个靶基因PPI网络图。筛选出的关键基因中的BDNF可能为miR-30d-5p作用的ADHD发病机制相关的基因。5.SHR大鼠PFC（prefrontal cortex）中miR-30d-5p和BDNF在mRNA和蛋白表达水平明显低于WKY大鼠。细胞实验中转染miR-30d-5p过表达质粒和腺相关病毒后,BDNF较对照组升高。6.注射miR-30d-5p病毒载体组大鼠在旷场实验和迷宫实验中,多动症状和注意力表现明显好于对照组。对注射转染组和对照组的PFC检测发现,与对照组相比,转染组大鼠PFC中miR-30d-5p和BDNF的表达水平明显升高,与体外细胞实验结果一致。结论1.miR-30d-5p在ADHD患儿外周血清中差异表达显著,具有作为ADHD诊断生物标记物的潜力。2.通过生物信息学分析和实验验证发现miR-30d-5p在ADHD中直接或间接作用于BDNF基因参与注意缺陷多动障碍疾病的发生发展。
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