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本论文工作对产精氨酸突变株进行代谢工程改造，通过对精氨酸生物合成途径中的关键节点γ-谷氨酰激酶以及中心代谢途径中的关键节点磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和丙酮酸羧化酶进行修饰，研究了阻断精氨酸合成的代谢旁路以及增强中心代谢途径流量对菌株生理特性的影响。
γ-谷氨酰激酶(gamma-glutamyl kinase，EC：2.7.2.11，ProB)催化谷氨酸生成γ-谷氨酰磷酸，是L-脯氨酸生物合成途径的第一步反应，该反应导致进入L-精氨酸生物合成途径的碳流减少。本工作以钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)产L-精氨酸突变株8-193为出发菌株，构建了proB基因敲除的菌株C.crenatum8-193-△proB，并使用带有proB基因的棒杆菌表达载体对基因敲除菌株进行互补。PCR验证、ProB酶活测定和营养缺陷型鉴定的结果表明，8-193-△proB确实是proB基因敲除菌株。对8-193-△proB进行了发酵实验，发现8-193-△proB较出发菌株8-193进入对数期和稳定期时间早，且进入稳定期之前生物量高于8-193，但最终的生物量低于出发菌株9.6％。8-193-△proB的葡萄糖利用略快于出发菌株8-193，合成L-精氨酸的速率一直高于8-193，最终积累浓度比出发菌株8-193提高了13.6％。对发酵液中的副产物氨基酸和有机酸进行了测定，发现天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸含量上升，乳酸和苹果酸含量有所提高，2-酮基戊二酸、磷酸烯醇式丙酮酸和琥珀酸含量降低。相关酶活测定结果表明，8-193-△proB的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶活性都有提高，说明8-193-△proB的回补代谢流增强。
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP carboxykinase，EC：4.1.1.32，PEPCk)是中心代谢途径的回补酶，催化草酰乙酸脱羧生成磷酸烯醇式丙酮酸的反应。本工作从8-193出发，构建了该基因的敲除菌株8-193-△pck和双基因敲除菌株8-193-△proB-△pck，并对两株基因敲除菌株进行互补。PCR验证和PEPCk酶活测定表明，8-193-△pck和8-193-△proB-△pck基因组上的pck基因确实已被敲除。分别进行了发酵实验，发现8-193-△pck的生物量一直低于8-193。对数中期之前，8-193-△pck的葡萄糖利用略快于出发菌株8-193，对数中期之后，8-193-△pck的葡萄糖利用明显快于8-193，8-193-△pck合成L-精氨酸的速率一直高于8-193，最终积累比8-193提高了18.1％。8-193-△proB-△pck在生长延滞期生物量比8-193低，对数期，8-193-△proB-△pck生长速率高于8-193，两株菌最终的生物量没有显著差别。8-193-△proB-△pck的葡萄糖利用略快于出发菌株8-193，对数中期之后，8-193-△proB-△pck的葡萄糖利用明显快于8-193，L-精氨酸的合成速率一直高于8-193，最终积累浓度比8-193提高了27.9％。发酵液中的副产物氨基酸和有机酸进行了测定，8-193-△pck发酵液中天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸浓度提高，8-193-△proB-△pck发酵液中副产物氨基酸的变化趋势与8-193-△pck相似。8-193-△pck发酵液中乙酸和乳酸含量较8-193有明显下降，丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸含量也有所下降，而柠檬酸、琥珀酸、苹果酸和2-酮基戊二酸含量增加，8-193-△proB-△pck发酵液中，乙酸、乳酸、丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸含量降低，柠檬酸、苹果酸和2-酮基戊二酸含量增加。
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，EC：6.4.1.1，PYC)也是中心代谢途径的回补酶，催化丙酮酸生成草酰乙酸。本工作克隆了8-193的pyc基因，并在8-193和8-193-△proB-△pck中得到表达，构建重组菌株8-193(pAC)和8-193-△proB-△pck(pAC)。发酵实验表明，8-193(pAC)的生长速率一直快于出发菌株，最终的生物量高于出发菌株7.3％，其葡萄糖利用略快于出发菌株，合成L-精氨酸的速率一直高于出发菌株，最终积累浓度提高了28.3％。对数期时，8-193-△proB-△pck(pAC)的生长速率一直快于出发菌株，进入稳定期后，生长速率下降，最终的生物量高于出发菌株7.5％。其葡萄糖利用略快于出发菌株，但没有显著差别。8-193-△proB-△pck(pAC)合成L-精氨酸的速率一直高于8-193(pAK6)，最终积累浓度提高了45.3％。发酵液中的副产物氨基酸和有机酸的测定表明，8-193(pAC)和8-193-△proB-△pck(pAC)发酵液中天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸浓度提高，而丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸浓度显著降低。8.-93(pAC)发酵液中乙酸、乳酸和丙酮酸含量较出发菌株有所降低，柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、2-酮基戊二酸和磷酸烯醇式丙酮酸含量增加，8-193-△proB-△pck(pAC)发酵液中，未能检测到乳酸，乙酸、丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸含量降低，柠檬酸、琥珀酸、苹果酸和2-酮基戊二酸含量增加。