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组氨酸-脯氨酸环二肽(cyclo(His-Pro),CHP)是由脯氨酸和组氨酸通过一对互补的肽键互相连接而形成的一种环二肽。药理学研究发现CHP具有缓解酒精麻醉、对抗某些中枢抑制药物的毒副作用,保护神经元、降血糖、抗氧化等生理功能,加之其抗酶解能力强,生物利用度高,这就有可能使之成为治疗某些疾病,特别是吸毒、嗜酒及糖尿病有效的一种短肽类药物。糖尿病是当今威胁人类健康的主要慢性代谢疾病之一,全世界有4.5亿人正遭受着糖尿病及其并发症的折磨。目前临床上治疗糖尿病的药物以西药(如α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖、格列美脲、二甲双胍、胰岛素制剂等)为主,虽然能不同程度调血糖水平,但长期用药会出现肝脏毒性等不良反应,且易产生“继发失效”,而且这些药物不能抑制或治疗对糖尿病并发症。因此寻找到一种疗效好、毒副作用低的降血糖药物或功能因子,成为糖尿病临床治疗的当务之急。具有降血糖活性的天然产物亦成为研究的热点。本研究以玉米蛋白粉为原料,利用可控酶解技术、高温高压合成技术和微波合成技术制备CHP,综合运用一系列先进的分离技术手段对得到的酶解液进行分离纯化,并采用液质联用、傅里叶红外光谱、核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance,NMR)等技术对分离得到的目标肽进行结构鉴定。最后考察了玉米CHP对实验型糖尿病小鼠血糖调节的影响,并初步探讨了降血糖机制,有望进一步开发成降血糖药物或功能性保健食品。与化学合成法相比,本研究的CHP制备方法具有反应路线短、原料廉价易得、后处理简单、生产周期短、绿色环保等优势,适于在工业化生产中推广。我国玉米蛋白资源丰富,利用率低,本研究的成果如能在实际中得以顺利实施,不仅能提高玉米蛋白的附加值,有效解决玉米淀粉加工中废弃物所造成的环境污染问题,而且能推进CHP降血糖类药物和保健品开发的进程,对开拓糖尿病及并发症防治的新途径以及新资源的利用具有重要的意义。研究内容及结果如下:1、采用连续累进提取法提取和纯化玉米蛋白,产物中蛋白质组分主要为醇溶蛋白(zein)、谷蛋白-1(G1-glutelin)和谷蛋白-2(G2-glutelin),分别占蛋白总量的51.33%、14.65%和19.74%。氨基酸分析结果表明G1-glutelin和G2-glutelin中组氨酸和脯氨酸含量较高。电泳分析结果显示三种提取蛋白均不是单一组分,而是由多条亚基组成。将三种蛋白的主要亚基带从SDS-PAGE电泳凝胶上切割下来,经胰蛋白酶水解后采用纳升级液相色谱串联质谱技术(nanoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry,Nano LC-MS/MS)进行鉴定,结果表明G1-glutelin和G2-glutelin中含有较多的组氨酸-脯氨酸(His-Pro)和脯氨酸-组氨酸(Pro-His)序列,是酶解制备CHP前体二肽的理想底物蛋白。2、选用四种常用的蛋白酶水解玉米谷蛋白,通过比较各种单酶和双酶水解产物水解度和CHP前体二肽得率的差异,得到酶解制备CHP前体二肽的最佳水解用酶为碱性蛋白酶-风味蛋白酶。采用正交实验对其酶解条件进行优化,得到的最佳酶解条件为:底物浓度40mg/mL,先加入11000 U/g的碱性蛋白酶水解7h,再加入17000U/g的风味蛋白酶,在pH 7.5、55℃下水解6h,在此条件下得到的酶解液中CHP前体二肽得率为7.38mg/g。3、综合运用醇沉、阴离子交换层析、凝胶层析及两步反相-高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)技术,在定量跟踪的基础上从玉米蛋白酶解液中分离富集CHP前体二肽,最终得到的组分Q-A2-a-I中CHP前体二肽含量为98.15%。氨基酸分析表明组分Q-A2-a-I仅含有组氨酸和脯氨酸两种氨基酸,其物质的量之比为组氨酸:脯氨酸=1:1.18;综合运用超高效液相色谱串联质谱技术(ultra high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)及计算最终鉴定出Q-A2-a-I中目标肽的氨基酸序列结构为His-Pro和Pro-His,分子量分别为252.6Da和252.7Da。采用1H-NMR和13C-NMR对Q-A2-a-I进行结构鉴定,结果表明组分Q-A2-a-I的结构为目标化合物。4、分别将高温高压合成技术和微波合成技术应用于玉米CHP的制备,分别从CHP前体二肽和玉米蛋白水解物出发,以水为溶剂,分别采用高温高压和微波技术对其进行环化,制备玉米CHP。通过单因素试验优化,得到CHP前体二肽高温高压环化的最优工艺条件为:反应压力0.2MPa,反应温度120℃,反应时间6h,底物浓度为20mg/mL,溶液pH值为8.0,在此条件下对CHP前体二肽纯品进行环化,得到的反应得率为93.25%;若从玉米蛋白水解物出发,其高温高压环化的最优工艺条件为:反应压力0.2MPa,反应温度120℃,反应时间6.5h,底物浓度30mg/mL,溶液pH值8.0,在此条件下,玉米蛋白水解物中的His-Pro和Pro-His线性二肽可直接发生分子内环化,环化反应得率为91.87%;CHP前体二肽微波环化的最佳条件为:单位体积的溶液吸收的微波能(即微波功率密度)为9W/mL,反应时间45min,底物浓度25mg/mL,溶液pH值8.0,在此条件下环化反应得率为76.42%。玉米蛋白水解物微波环化的最佳条件为:微波功率密度9W/mL,反应时间55min,底物浓度30mg/mL,溶液pH值8.0,在此条件下环化反应得率为73.59%。综合比较高温高压环化法、微波环化法和乙醇回流法,可以得出利用高温高压环化法一步合成CHP,不仅反应得率最高,反应时间相对较短,而且具有工艺简单、生产成本低、绿色环保等优点,适合玉米CHP的大批量生产。5、以高温高压环化后的玉米蛋白酶解物为原料,采用离子交换色谱、凝胶过滤色谱和半制备型RP-HPLC技术从酶解液中分离富集CHP,成功建立了玉米CHP的分离、纯化体系,最终得到的组分A2-b中玉米CHP含量为97.36%,纯化倍数为45.1倍。将纯化后的终产物进行UPLC-MS/MS测定,鉴定出组分A2-b中目标肽的氨基酸序列结构为cyclo(His-Pro),分子量为235.7Da。NMR和傅里叶红外光谱的结构鉴定结果显示,组分A2-b为目标化合物。体外降血糖和抗氧化试验结果表明,采用本研究建立的分离纯化方法得到的玉米CHP表现出最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性、DPPH自由基清除活性和还原力。反应动力学和分子对接模拟结果表明,玉米CHP能够竞争性地抑制α-葡萄糖苷酶活性,IC50值为1.3mg/mL,抑制常数为1.02mg/mL。CHP可进入α-葡萄糖苷酶的底物结合部位,通过范德华力、氢键等分子间作用力与酶活性中心及周围氨基酸残基产生相互作用,发挥抑制作用,为后续体内降血糖研究和进一步开发提供一定的基础和依据。6、以四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠为模型,将纯化后的玉米CHP按一定剂量进行长期灌胃给药,实验结果表明,玉米CHP能在一定程度上缓解糖尿病小鼠的多饮、多食、多尿及消瘦症状,降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平,改善口服糖耐量,促进胰岛素的分泌。此外,玉米CHP可降低糖尿病小鼠的血脂水平,能在一定程度上改善糖尿病小鼠的脂代谢紊乱。此外,实验中还发现玉米CHP能够降低糖尿病小鼠血清中一氧化氮(nitric oxide,NO)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,表明玉米CHP能够清除四氧嘧啶产生的NO和氧自由基,降低脂质过氧化,缓解氧化应激对机体的损害。组织病理学分析结果表明,玉米CHP对四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠所致胰腺和肝脏损害具有一定的改善作用。实验结果表明,玉米CHP的小鼠体内降血糖机制为通过清除四氧嘧啶产生的NO和氧自由基,提高机体抗氧化功能,抑制氧化应激作用对胰岛β细胞、肝脏等组织的损伤,对胰岛β细胞和肝细胞损害具有一定的保护和修复作用,从而促进胰岛素的分泌,缓解糖尿病并发症。