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目的:以多巴胺能MN9D细胞为模型,研究锰对多巴胺能神经元损伤、凋亡与功能的影响及其分子机制,探讨在此过程中锰作用下MN9D细胞MEK5/ERK5信号通路产生变化的特点以及参与调控的机制。方法:采用体外细胞培养方法,将细胞分为:空白对照组(Mn2+:0μmol/L,C组),低剂量染锰组(Mn2+:400μmol/L,L组),中剂量染锰组(Mn2+:800μmol/L,M组),高剂量染锰组(Mn2+:1200μmol/L,H组),抑制剂对照组(BIX02189:10μmol/L,BC组),抑制剂+低剂量染锰组(BIX02189:10μmol/L+Mn2+:400μmol/L,BL组),抑制剂+中剂量染锰组(BIX02189:10μmol/L+Mn2+:800μmol/L,BM组),抑制剂+高剂量染锰组(BIX02189:10μmol/L+Mn2+:1200μmol/L,BH组),每组染锰时间均为24h。利用倒置显微镜观察各组细胞形态,MTT比色法检测细胞活力,Hoechst33258荧光探针染色观察凋亡小体,Annexin V/PI双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡率,DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平,竞争ELISA法检测细胞培养液中DA含量,Western Blot与RT-q PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、MEK5、p-MEK5、ERK5、p-ERK5等蛋白和基因的表达。结果:1、MTT实验发现在染毒24h和48h两个时间段的各浓度组中细胞存活率差异均有统计学意义(P<0.05),且均随着染锰剂量的增加而降低,具有剂量-效应关系;在染毒72h的各浓度组中,细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05),其余各染锰组的细胞存活率与空白对照组比较,均随着染锰剂量的增加而降低(P<0.05),具有剂量-效应关系。BC组与对照组细胞凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05);随着染锰剂量逐渐增加,MN9D细胞凋亡率也逐渐增加,与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05),具有剂量效应关系;经过抑制剂预处理后的染锰组,与BC组比较,凋亡率也逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05),具有剂量效应关系;且L组与BL组、M组与BM组、H组与BH组比较,用抑制剂预处理后再染毒的细胞凋亡率有所增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。2、倒置显微镜观察发现,C组和BC组细胞生长正常,胞体丰满,分化良好,突触细长且有分支,随着染锰浓度的增加,细胞突触逐渐变短或消失,且细胞漂浮增多,并逐渐裂解产生细胞碎片,经抑制剂预处理后再染毒发现,相比未经过抑制剂处理的染锰组,细胞皱缩变圆以及漂浮细胞更加明显,且产生大量的细胞碎片。3、Hoechst 33258荧光探针染色发现空白组和单纯抑制剂预处理(未染锰)组细胞呈弱蓝色,随着染锰浓度的增加,看到细胞核呈致密浓染的凋亡细胞逐渐增多,经抑制剂预处理后再染毒发现,相比未经过抑制剂处理的染锰组,细胞核呈致密浓染的凋亡细胞更加明显,细胞核膨大增多,细胞核染色质凝聚且边缘化,核小体形成明显,且有碎块状致密浓染产生。4、在双变量流式散点图中显示,随着锰浓度增高,凋亡率亦逐渐升高。与C组相比,L、M、H组细胞凋亡率均升高(P<0.05)。5、DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平发现不同浓度的锰作用于细胞后,细胞中的ROS含量均明显增高。除BC组,其余各组分别与C组比较,ROS含量均增高(P<0.05),BM组与M组比较,BH组与H组比较,ROS含量均增高(P<0.05)。6、竞争ELISA法检测细胞培养液中DA的含量,结果显示,BM、BH组分别与C组比较,细胞分泌的DA含量降低(P<0.05);BM组与M组比较,以及BH组与H组比较,经抑制剂预处理后再染锰的细胞DA分泌有所下降(P<0.05)。7、Western Blot技术检测各组目的蛋白的表达量,结果显示MN9D细胞经锰刺激后Bcl-2表达量与对照组比较有所下降(P<0.05),BL、BM、BH组Bcl-2蛋白表达下降明显,分别与L、M、H组比较,其蛋白表达量下降(P<0.05);Bax蛋白表达量随着染锰浓度增加,其表达量亦随之升高(P<0.05),其中BL、BM、BH组增加较为明显,分别与L、M、H组比较,其蛋白表达量均升高(P<0.05);Bcl-2与Bax蛋白表达量比值随着染锰剂量的增加而逐渐降低(P<0.05),同样,经过抑制剂预处理后的BL、BM、BH组比值下降较为明显,分别与L、M、H组比较,其差异有统计学意义(P<0.05);Caspase-3蛋白表达量在除L组外的其余各组表达量均有所增加(P<0.05);MEK5与ERK5总蛋白的表达量与对照组比较,其差异均无统计学意义(P>0.05)。锰刺激MN9D细胞后p-MEK5表达量在M、H组增加较为明显,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),BM、BH组分别与M、H组比较,其蛋白表达量增加(P<0.05);p-MEK5与MEK5蛋白表达量比值在M、H、BM、BH组增大,分别与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);p-ERK5蛋白表达量随着染锰剂量的增加而逐渐升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),而经抑制处理后的BC、BL、BM和BH组p-ERK5蛋白表达量与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);p-ERK5与ERK5蛋白表达量比值在M、H组增大,分别与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。8、实时荧光定量PCR测定相关目的基因显示,MN9D细胞经锰刺激后Bcl-2 m RNA表达与对照组比较均有所下降(P<0.05),BH组H组比较,其m RNA表达量下降(P<0.05);Bax m RNA表达量M和BM组与C组比较,升高差异有统计学意义(P<0.05);Bcl-2与Bax表达量比值随着染锰剂量的增加而逐渐降低(P<0.05),BL、BH组分别与L、H组比较,其比值下降(P<0.05);Caspase-3 m RNA表达量在L、M与BH组比对照组有所下降(P<0.05),而在H与BM组,其表达量比对照组升高(P<0.05);各组MEK5 m RNA的表达量与对照组比较,除H组表现为升高(P<0.05)和BH组表现为下降(P<0.05)外,其余各组差异均无统计学意义(P>0.05);各组ERK5 m RNA表达量与对照组比较,除H与BM组表现为升高(P<0.05),M、BH组表现为下降(P<0.05)外,其余各组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:Mn Cl2诱导的ERK5通路的激活在Mn致MN9D细胞毒性作用中发挥了抗损伤、抗凋亡的作用。