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目的:布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏菌(brucella)感染导致的一种人畜共患病。慢性程度高,免疫机制不清。本研究以布鲁氏菌病为疾病模型,探讨巨噬细胞极化和程序性死亡蛋白1(Programmed death 1,PD-1)及其配体2(Programmed cell death ligand2,PD-L2)通路在布鲁氏菌病发生发展中的作用及分子机制,为研究布鲁氏菌感染的免疫机制提供新的理论依据。通过研究明确布鲁氏菌持续感染时巨噬细胞极化特点以及淋巴细胞亚群的变化特点;阐明M2型巨噬细胞通过PD-1/PD-L2途径变化调控Th细胞的机制;探讨外膜蛋白2b(Outer membrane protein 2b,Omp2b)蛋白对巨噬细胞极化的影响。方法:(1)对581例布鲁氏菌病患者进行人口学,流行病学,临床特征和实验室检查特点分析。收集2017年9月至2019年6月就诊于维吾尔自治区人民医院住院和门诊的布鲁菌患者共126例,同期120例体检健康志愿者作为健康对照人群。通过流式细胞术检测外周血M1和M2型巨噬细胞以及PD-L2的表达;荧光定量PCR和Western Blot检测iNOS、Arg-1、TNF-α、IL-1RA的mRNA和蛋白表达。Aimplex法检测血清中TNF-α、IL-1RA水平。通过体外试验观察被布鲁氏菌刺激后的巨噬细胞功能特点改变。(2)通过流式细胞术检测外周血中淋巴细胞亚群,Th1,Th2,Th17,Treg细胞及其上PD-1的表达变化。荧光定量PCR和Western Blot检测T-bet、GATA-3、IFN-γ、IL-4的mRNA和蛋白表达。Aimplex法检测血清中IFN-γ和IL-4水平。通过分选布鲁氏菌患者的M2细胞和健康对照人群的CD4~+T细胞,进行体外刺激试验。分别对PD-L2进行增强或阻断,以及对PD-1阻断,观察荧光定量PCR和Western Blot检测T-bet、GATA-3、IFN-γ、IL-4的mRNA和蛋白表达;Aimplex法检测IFN-γ和IL-4的变化情况。(3)将THP-1细胞诱导为M1和M2型巨噬细胞,加入Omp2b蛋白进行体外培养试验。通过流式细胞术检测CD86、CD80、CD206和CD163表达情况;荧光定量PCR和Western Blot检测iNOS、Arg-1、TNF-α和IL-1RA的mRNA和蛋白表达。Aimplex法检测TNF-α、IL-6、IL-1RA、IL-10的水平变化情况。观察Omp2b蛋白对M1和M2型巨噬细胞的影响。使用生物信息学分析Omp2b蛋白并进行免疫原性检验。结果:(1)流式细胞术检测发现M2型巨噬细胞在布鲁氏菌病时增加,PD-L2在M2细胞上表达降低。荧光定量PCR和Western Blot在分子和蛋白水平检测表明iNOS和TNF-α轻度增加,Arg-1和IL-1RA显著增加,Arg-1/iNOS和IL-1RA/TNF-α显著增加。血清中TNF-α增高,IL-1RA显著增高,IL-1RA/TNF-α显著增高。体外试验结果发现被布鲁氏菌刺激后的巨噬细胞吞噬能力下降,未刺激组的iNOS、TNF-α的mRNA和蛋白水平下降,而Arg-1、IL-1RA的mRNA相对水平升高。CD206表达上调,CD86、PD-L2和HLA-DR表达下调。(2)流式细胞术检测发现,CD3~+T比例无明显变化,CD4~+T比例下降,CD8~+T、CD19~+B、CD16+56~+NK细胞比例增多,绝对数量检测发现所有淋巴细胞都增加。Th1降低,Th2增多,Th17不变,Treg增高,PD-1在Th1、Th2、Treg细胞上的表达增高。血清中IFN-γ轻度增加,IL-4明显增加,IL-4/IFN-γ显著增加。T-bet的mRNA和蛋白水平无明显变化,GATA-3和IL-4的mRNA和蛋白水平则升高,IFN-γ的mRNA和蛋白水平升高。体外试验结果发现,在加入了PD-L2后,M2型巨噬细胞会上调T-bet和IFN-γ的表达水平,并下调GATA-3和IL-4的表达水平。在加入了Anti-PD-L2后,M2型巨噬细胞会进一步下调T-bet的表达水平,并上调GATA-3和IL-4的表达水平,阻断PD-L2后则会得到相反的结果。加入PD-L2使T-bet和IFN-γ的表达水平升高后,进一步加入Anti-PD-L2阻断PD-L2可以下调T-bet和IFN-γ的表达水平。在加入PD-L2并阻断PD-L2后,T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-4的表达水平恢复到与M2组相同的水平。在阻断PD-L2或者阻断PD-1后T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-4的表达水平无明显差异。(3)体外试验表明,Omp2b刺激后的M2细胞上的CD86、CD80的表达水平上调,CD206和CD163表达水平下调;iNOS、TNF-α的mRNA和蛋白水平上调,Arg-1、IL-1RA的mRNA和蛋白水平下调;TNF-α,IL-6水平增多,IL-1RA、IL-10水平降低。Omp2b刺激后的M1细胞上的iNOS、Arg-1、IL-1RA的mRNA和蛋白无变化;TNF-α,IL-6水平增多,IL-1RA、IL-10水平无明显变化。生物信息学分析发现Omp2b蛋白中有3个Th表位、7个CTL表位,8个B细胞表位和1个TB联合表位,可以有效刺激宿主产生免疫应答。结论(1)布鲁氏菌病患者体内巨噬细胞以M2型极化占优势,M2型巨噬细胞上的PD-L2表达下调。体外试验表明布鲁氏菌能诱导巨噬细胞向M2方向极化以及表型改变,PD-L2参与了巨噬细胞极化及免疫应答改变。(2)布鲁氏菌病患者外周血中CD4~+T淋巴细胞亚群数量增加,CD4/CD8比值下降。Th1细胞比例降低,Th2细胞比例增多,Treg细胞比例增多,Th1、Th2、Treg上的PD-1增高,PD-1参与了CD4~+T亚群的调控。体外试验表明M2型巨噬细胞通过PD-1/PD-L2途径影响Th1/Th2平衡参与布鲁氏菌病的发生发展。(3)Omp2b蛋白能够抑制M2型极化,并促进M2型巨噬细胞向M1方向转变。生物信息学分析发现Omp2b蛋白中有10个T细胞表位,8个B细胞表位和1个T-B联合表位,可以有效刺激T细胞产生IFN-γ,发生Th1型免疫应答,有助于抵抗布鲁氏菌感染。