山羊chi_circ_0006511对肌内脂肪细胞分化的调控作用

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山羊作为家养动物,是肉类的主要来源之一,与牛肉、猪肉相比,羊肉具有独特的风味,因此而受到消费者的广泛推崇。羊肉脂肪含量的高低不仅影响羊肉的肉质,而且还直接关系到羊肉的经济价值,因此阐明山羊脂肪沉积的分子机制是进行分子育种的关键环节之一。研究表明,动物脂肪细胞分化不仅受功能基因的调控,还受非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)的调控。环状RNA(circRNA)作为一种新型的内源性非编码RNA,从转录后水平对细胞重要生物过程发挥独特的调控作用。目前在猪和牛等家畜中已经开展了一些关于circRNAs在脂肪沉积方面的研究,但尚未见关键circRNA调控肉用山羊肌内脂肪细胞分化的报道。因此本研究以实验室前期利用高通量测序筛选出来在山羊肌内脂肪细胞分化过程中差异表达的chi_circ_0006511为研究对象,通过细胞培养、细胞转染、RT-PCR、实时荧光定量PCR、荧光原位杂交和双荧光素酶报告基因检测系统等多种方法,探究山羊chi_circ_0006511对肌内脂肪细胞分化的调控作用及可能的分子机制。(1)山羊chi_circ_0006511的鉴定及对肌内脂肪细胞分化的影响利用RNase R处理、RT-PCR并综合Sanger测序结果,鉴定chi_circ_0006511在山羊肌内脂肪细胞中表达且成环;亚细胞定位发现,山羊chi_circ_0006511在细胞核和细胞质中均有分布;chi_circ_0006511在山羊肌内脂肪细胞分化的0 h到84 h逐渐上升,并在84 h达到峰值,在84 h到120 h逐渐下降;过表达chi_circ_0006511,促进山羊肌内脂肪细胞中的脂质积累,成脂分化相关基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ等m RNA表达水平都呈极显著上调(P<0.01);干扰chi_circ_0006511,抑制山羊肌内脂肪细胞中的脂质积累,成脂分化相关基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ等m RNA表达水平都呈极显著下调(P<0.01)。(2)chi_circ_0006511/novel-mi R-87/CD36竞争关系的鉴定利用双荧光素酶报告基因检测系统,分别对转染mi R-87-mim NC+chi_circ_0006511WT、mi R-87-mim NC+chi_circ_0006511MT、mi R-87-mim+chi_circ_0006511WT、mi R-87-mim+chi_circ_0006511MT双荧光素酶活性进行检测,相较于mi R-87-mim NC+chi_circ_0006511MT组,mi R-87-mim NC+chi_circ_0006511WT组无显著变化(P>0.05),mi R-87-mim+chi_circ_0006511WT组极显著下调(P<0.01),mi R-87-mim+chi_circ_0006511MT无显著变化(P>0.05),表明chi_circ_0006511靶向结合novel-mi R-87;恢复实验结果进一步证明,novel-mi R-87 inhibitor可以挽救单独干扰chi_circ_0006511对山羊肌内脂肪细胞分化的抑制作用。对转染mi R-87-mim NC+CD36-3’WT、mi R-87-mim NC+CD36-3’MT、mi R-87-mim+CD36-3’WT、mi R-87-mim+CD36-3’MT双荧光素酶活性进行检测,相较于mi R-87-mim NC+circ_CD36-3’MT组,mi R-87-mim NC+CD36-3’WT组无显著变化(P>0.05),mi R-87-mim+CD36-3’WT组极显著下调(P<0.01),mi R-87-mim+CD36-3’MT无显著变化(P>0.05),表明novel-mi R-87和CD36存在靶向结合关系。(3)山羊novel-mi R-87靶向CD36调控山羊肌内脂肪细胞分化在山羊肌内脂肪细胞中模拟novel-mi R-87表达,抑制肌内脂肪细胞中的脂质积累,成脂分化标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ等m RNA表达水平都呈极显著下调(P<0.01);在山羊肌内脂肪细胞中抑制novel-mi R-87表达,肌内脂肪细胞中的脂质积累明显增加,成脂分化基因PPARγ显著上调(P<0.05),C/EBPα、C/EBPβ等的m RNA表达水平都呈极显著上调(P<0.01)。模拟novel-mi R-87后CD36表达量极显著下调(P<0.01),抑制novel-mi R-87后CD36表达量极显著上调(P<0.01)。利用CRISPR/Cas9构建了山羊CD36敲除载体,敲除效率约69%。油红O和Bodipy染色结果发现敲除CD36后,山羊肌内脂肪细胞中的脂质沉积明显减少,成脂分化标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ和LPL m RNA表达水平极显著下调(P<0.01)。以上结果表明,chi_circ_0006511是山羊肌内脂肪细胞分化的正向调控因子,chi_circ_0006511可以海绵吸附novel-mi R-87,从而解除novel-mi R-87对CD36的抑制作用,促进山羊肌内脂肪细胞的分化,即chi_circ_0006511通过novel-mi R-87/CD36轴促进山羊肌内脂肪细胞分化,本研究为构建山羊肌内脂肪细胞分化调控网络提供新的理论和实验依据,为最终揭示山羊肌内脂肪沉积的调控机制奠定基础,同时为分子育种和良种选育提供理论依据。
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