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意义乳腺癌是世界范围内女性最为常见的恶性肿瘤,在女性因癌症致死原因中占据主导地位。三阴性乳腺癌(TNBC)定义为缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)以及人表皮生长因子受体2(HER2)基因的特殊乳腺癌亚型,占乳腺癌全部类型15-20%。TNBC具有高风险的转移与复发率,目前仍缺乏有效的治疗措施。天然化合产物Ilamycin家族,来源于海洋微生物次级代谢产物,其细胞毒活性从来没有被报道过。有初步研究结果显示,化合物Ilamycin具有抗肿瘤活性,但仍需进一步深入研究。方法1.SRB法检测细胞存活率,反映化合物Ilamycin E,F对乳腺癌细胞存活的影响。使用不同浓度 Ilamycin E,F 在 HCC 1806,HCC 1937,MDA-MB-468,MDA-MB-231,T47D,MCF7,SKBR3,BT474,MCF10A 细胞系验证效果,并进一步用SRB的方法测定每株细胞系准确的IC50。最后根据实验需要选出作为研究的代表细胞系,作为后续实验的材料。2.EdU检测细胞增殖为了检测Ilamycin E对细胞增殖的影响,以不同浓度Ilamycin E(0,10,20,30μM)处理 HCC1937 和 MDA-MB-468 细胞 24 小时,以 EPI(0.2μM)作为阳性对照,然后用Click-iT EdU试剂盒进行处理,最后封片拍照,所得结果用ImageJ和IPP软件处理,从每个处理结果中选择3张图片进行统计、处理,所得比值作为最后结果。3.细胞周期试验为了进一步分析Ilamycin E导致细胞存活抑制的主要方式,我们使用流式细胞仪检测化合物对细胞周期进程的影响。用IlamycinE不同浓度(0,10,20,30μM)处理HCC1937,MDA-MB-468细胞24小时,胰酶消化,75%乙醇4℃固定。最后以大约1x106个细胞用100 μl 0.6%NP40+1μl PI+1 μ1 RNase的比例配成体系,重悬细胞。染色处理,AccuriC6(BD)上机分析细胞周期,软件FlowJo分析统计结果。4.细胞凋亡分析为了检测化合物Ilamycin E对细胞凋亡的影响,我们使用Annexin V和PI双染流式细胞方法检测化合物Ilamycin E对细胞凋亡的影响。使用Ilamycin E不同浓度(0,10,20,30μM)处理HCC1937细胞24小时,处理MDA-MB-468细胞36小时,Annexin V和PI双染流式细胞仪上机检测、分析细胞凋亡情况。5.蛋白印迹检测周期和凋亡相关蛋白的改变,用以探索凋亡机制为了探讨细胞周期和凋亡改变的机制,我们做了大量蛋白筛查,使用不同浓度Ilamycin E(0,10,20,30μM)处理48小时或用30μM单浓度处理HCC1937,MDA-MB-468细胞不同时间,加细胞裂解液冰上裂解30min,离心,蛋白定量,然后加4×SDS Loading Buffer,98 ℃ 5min煮样变性,上样,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,转膜,抗体孵育14小时,二抗孵育2小时,曝光仪检测检测各个目标条带变化情况。使用Photoshop作图软件进行数据处理。6.数据处理为了保证数据的准确性,实验数据进行至少三次独立重复的验证。使用软件SPSS运算t检验进行显著性分析,P值<0.05则认为有显著性差异。流式结果使用FlowJo处理,柱形图和线形图使用GraphPad制作。Edu结果使用ImageJ,IPP进行重叠计数。结果1.SRB细胞存活率检测结果显示,化合物Ilamycin E对HCC 1806,HCC 1937,MDA-MB-468,MDA-MB-231,T47D,MCF7,SKBR3,BT474,MCF10A 细胞具有广泛的细胞毒活性,同时化合物Ilamycin F不具有或在所给有效剂量范围内不具有细胞毒活性。化合物IC50检测结果显示,Ilamycin E对细胞有效IC50分布为14.24-49.19μM,三阴性乳腺癌细胞HCC1937细胞系最为敏感,而人永生化乳腺上皮细胞MCF10A细胞系敏感性最差。化合物Ilamycin E与F的结果差异表明Ilamycin家族化合物细胞毒活性具有特定的化学基团,这为化合物的改造指明了方向。2.EdU细胞增殖实验结果显示,化合物Ilamycin E显著抑制三阴性乳腺癌细胞系HCC1937和MDA-MB-468的DNA合成,减少细胞分裂,证明细胞增殖受到抑制。因此,我们初步得出结论,即化合物Ilamycin E导致的细胞存活抑制部分归功于细胞增殖抑制。3.流式细胞周期检测结果显示,随着化合物Ilamycin E有效作用浓度的递增,Ilamycin E显著增加HCC1937和MDA-MB-468两株三阴性乳腺癌细胞G0/G1期细胞比例,并降低细胞S期和G2/M期细胞比例,化合物Ilamycin E有效抑制HCC1937 和 MDA-MB-468 细胞 G1/S 进程。4.流式细胞凋亡实验结果显示,化合物Ilamycin E明显导致HCC1937和MDA-MB-468两株三阴性乳腺癌细胞凋亡比例增加,并且随着化合物Ilamycin E有效作用浓度的增加,细胞凋亡比例逐渐增加。实验结果表明,化合物Ilamycin E导致的细胞存活抑制部分原因归功于诱导细胞凋亡。5.使用蛋白印迹实验经过大量筛查表明,Ilamycin E明显导致三阴性乳腺癌细胞系HCC1937和MDA-MB-468 一系列周期、凋亡相关蛋白的变化。同时,Real-time PCR检测结果显示,化合物Ilamycin E下调KLF5以及上调EGR1的转录。而ERStress信号通路相关蛋白Bip,IRE1α,XIAP,CHOP均有显著增加。实验结果表明,化合物IlamycinE在调控细胞周期、凋亡相关蛋白表达的同时,显著诱导细胞ER Stress信号通路的活化。结论本研究结果显示,Ilamycin家族成员IlamycinE具有潜在的抗三阴性乳腺癌活性。化合物Ilamycin E导致三阴性乳腺癌HCC1937和MDA-MB-468细胞周期相关蛋白Cyclin D1显著下降,而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21、p27显著上升,并引起细胞G1/S期细胞周期进程阻滞。化合物IlamycinE还能有效诱导HCC1937和MDA-MB-468细胞ER stress的产生,并导致细胞凋亡。实验还发现化合物Ilamycin E能有效抑制KLF5转录,同时上调肿瘤抑制因子EGR1的表达。综合结果表明化合物IlamycinE能有效抑制三阴性乳腺癌,这或许将为三阴性乳腺癌的治疗提供更多的可能。