【摘 要】
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背景:目前平均生育年龄在逐步提高,加上我国全面二胎政策的开放,高龄生育的现象越来越常见,所以研究年龄因素对生殖的影响显得越来越重要。多项研究表明,miRNAs调控着生理病理细胞分化过程和代谢稳态的关键基因表达。前期研究中我们筛选出了老龄雄鼠精子中高表达的miR-125a。并且miR-125a具有高度的人鼠同源性,本研究通过检测临床高龄病人和高龄小鼠的精子中miR-125a的表达情况,进行细胞实验明
【基金项目】
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线粒体相关miRNA-125a-5p通过ROS/OxLDL途径调控高龄男性精子损伤的机制研究,江苏省自然科学青年基金项目（BK20190252）；
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背景:目前平均生育年龄在逐步提高,加上我国全面二胎政策的开放,高龄生育的现象越来越常见,所以研究年龄因素对生殖的影响显得越来越重要。多项研究表明,miRNAs调控着生理病理细胞分化过程和代谢稳态的关键基因表达。前期研究中我们筛选出了老龄雄鼠精子中高表达的miR-125a。并且miR-125a具有高度的人鼠同源性,本研究通过检测临床高龄病人和高龄小鼠的精子中miR-125a的表达情况,进行细胞实验明确其具体的作用和调控机制,再通过胚胎实验探索其对早期胚胎发育的影响和机制,以期能在此基础上为临床提高高龄男性生育能力和改善生育结局提供帮助。材料和方法:通过对高龄小鼠和年轻小鼠的精子、卵母细胞和胚胎进行了小分子RNA的高通量测序,筛选出在高龄小鼠精子中高表达的小分子RNA,发现miR-125a是在高龄精子、胚胎中显著高表达的小分子RNA之一。构建小鼠自然高龄模型以及半乳糖（D-gal）诱导小鼠高龄模型,收集临床高龄和年轻男性精子样本。提取总RNA,应用RT-qPCR检测miR-125a的表达趋势,检测精子浓度、活力、DFI等,分析这些参数和miR-125a表达水平的相关性。选择小鼠精母细胞系GC2细胞,转染miR-125a的模拟剂和抑制剂,过表达或干扰miR-125a,检测其ROS、线粒体功能指标和细胞DNA损伤水平。预测miR-125a的靶点,发现RNA结合基序蛋白38（RNA-bindingmotifprotein38,Rbm38）可能是其靶点,之后用RT-qPCR和蛋白质印迹法检测其RNA和蛋白质表达,并通过荧光素酶报告实验验证。体外培养高龄和年轻小鼠胚胎,部分年轻组胚胎通过显微注射miR-125a模拟剂过表达miR-125a,观察其胚胎发育情况,并提取RNA和进行免疫荧光实验,了解miR-125a的表达情况和其对胚胎早期发育的影响以及影响的机制。结果:两种高龄小鼠模型及临床高龄男性精子中,miR-125a明显高表达;精子浓度、活力及前向运动能力明显下降,与miR-125a表达负相关;DFI明显上升,与miR-125a表达正相关。在细胞实验中,过表达miR-125a的GC2细胞的线粒体功能受损,Rbm38表达量下降,依赖于p53的DNA损伤增加;干扰miR-125a后,Rbm38表达量上升,细胞DNA损伤减少,并改善线粒体功能。荧光素酶报告实验结果提示Rbm38是miR-125a的直接作用靶标。胚胎实验结果表明,高龄雄鼠精子会影响小鼠囊胚形成,过表达miR-125a后也得到相似的结果,考虑是因为miR-125a过表达减少Rbm38的表达,同时激活p53-p21通路,导致细胞周期阻滞,降低囊胚形成率。结论:miR-125a通过直接靶向Rbm38激活p53引起依赖于p53的DNA损伤增加,损伤线粒体功能,引起精子损伤,并可影响细胞周期进程,导致早期胚胎发育受阻,这可能是高龄男性精子质量变差和导致不良生育结局的原因之一。
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