我国是肝病大国,各种原因导致的终末期肝病给人体健康带来严重危害,给家庭和社会带来沉重负担,也给护理人员带来巨大压力。随着终末期肝病的发病率和死亡率逐年增加,护理人员在为越来越多的终末期肝病患者提供高质量的护理方面发挥着至关重要的作用。终末期肝病目前公认的唯一有效治疗方式就是肝移植,但是肝源的匮乏明显抑制了肝移植的广泛应用。近年来干细胞技术的快速发展给这一疾病的治疗开辟了新的路径,尤其是具有自我更新和向肝脏细胞和胆管细胞进行双向分化潜能的肝脏干细胞(HSCs)给肝病的治疗提供了新的细胞来源。众多的研究都在致力于如何获取肝脏干细胞,目前获取人肝脏干细胞的方式主要有两种,一种是从人体肝脏组织中通过分离培养获取原代肝脏干细胞,但是肝脏组织的获得毕竟有限而且困难。另外一种重要的方式是从人多能性干细胞(hPSCs)包括胚胎干细胞(hESCs)和诱导多能性干细胞(hiPSCs)通过诱导分化获得,由于hESCs已经稳定建系,hiPSCs可以取自病人皮肤细胞来建立,因此是HSCs的良好来源。但是目前由hPSCs诱导获得HSCs需要依赖滋养细胞的支持、或者血清的添加、或者通过基因修饰的手段,这些操作方式复杂、会引入异源性物质、难以大规模应用、也不符合临床应用的需求。因此需要建立一种全新的方法来获取和大量扩增肝脏干细胞来满足大规模的临床应用。目的:建立一种简单的、无血清、无滋养细胞添加的、可大规模获得肝脏干细胞的培养方法,并且明确证实其肝干细胞的属性,体内外功能特征和体内应用有效性、安全性,以满足临床应用的需求。方法:1以hESCs为来源,将其诱导到肝谱系特化的阶段(HS),以这一阶段为起始,采用三维类器官的培养方法,将细胞埋入细胞外基质胶中,并且添加类器官培养成分Advanced DMEM/F12、N2、B27、N-Acety-L-Cysteine、Gastrin、Nicotinamide、Glutamax、EGF、R-spondin1、A83-01和Forskolin,进行培养获得肝脏干细胞类器官(hEHOs)。2对hEHOs进行传代扩增能力、核型分析、肝干细胞特异性基因表达、蛋白表达的鉴定。3分别建立hEHOs向成熟肝细胞和胆管细胞分化的三维诱导方案。4从形态特征、胆管相关基因表达、蛋白表达、体外功能等对hEHOs来源的胆管细胞进行鉴定。5从形态特征、肝细胞相关基因表达、蛋白表达、肝细胞特异性的功能、FRG肝病模型小鼠的治疗等方面对hEHOs来源的肝细胞进行分析。6使用NOD-SCID小鼠附睾脂肪垫移植模型研究hEHOs在体内自由分化的情况以及体内应用的安全性。结果:1在我们建立的类器官培养条件下,肝脏类器官(hEHOs)可以从HS阶段逐渐开始产生并且可以扩增超过20代。2 hEHOs在扩增的过程中倍增时间基本保持不变,核型也维持正常。3 hEHOs表达肝脏干细胞特异性的蛋白及转录因子。4 hEHOs在体外分化形成胆管细胞表达胆管特异性的标志如CK19、SOX9、CFTR、ASBT、HNF6、HES1等,而且建立了胆管细胞的极性,能够行使胆管的排泌功能。5 hEHOs体外诱导产生的肝细胞表达肝细胞成熟的标志如ALB、CK18、AAT、TF、CYP3A4、CYP2C9、CPS1、ASS1等,执行肝脏的白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢、糖原合成、靛青绿摄取等功能。6 hEHOs移植入肝损伤小鼠模型的肝脏中,能够整合入小鼠肝实质并且产生肝脏的功能,逆转小鼠的肝损伤。7 hEHOs移植入NOD-SCID小鼠附睾脂肪垫中进行自由分化时,只能形成肝细胞或者胆管细胞,而不能形成内胚层其他的组织类型包括胃、肠、胰腺,更不会形成肿瘤组织。结论:1我们成功建立了一种无血清、无滋养细胞、简单、可规模化应用的从多能性干细胞诱导产生的具有双向分化潜能的肝脏干细胞类器官(hEHOs)的培养方式。2 h EHOs具有肝脏干细胞的典型属性,包括自我更新、体外能够分化产生功能性的肝脏细胞和胆管细胞,体内移植能够逆转模型小鼠的肝损伤。3 hEHOs具有肝谱系限制性,移植入体内不会产生非预期细胞类型,更不会形成肿瘤,具有良好的安全性。因此hEHOs为肝脏的发育研究、疾病模型、药物研发及肝病治疗提供了理想的种子来源。