研究背景:　　肺癌是全世界最常见诊断的恶性肿瘤，也是死亡率最高肿瘤之一，80％的患者是非小细胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)。改进和提高NSCLC病人的诊断和治疗是迫切需要解决的问题。　　瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)通道广泛分布于多种哺乳动物系统组织，参与调节各种细胞功能。根据其序列的相似性，TRP超家族可分为7个亚家族:TRPC(canonical)，TRPV(vanilloid)，TRPM(melastatin)，TRPN(Drosophila NOMPC),TRPA(ankyrin),TRPML(mucolipin)和TRPP(polycystin)。最近在非小细胞肺癌细胞诱导EMT转化实验模型中发现间质状态癌细胞中TRPC3在转录水平表达增高。然而，关于这种间质状态表达增高在癌细胞生长中功能还未知晓。　　本研究中，我们拟先在细胞水平上检测TRPC3通道在上皮状态和间质状态细胞系之间的表达差异，进一步检测其在癌细胞生长方面发挥的作用以及对活体成瘤的影响，并分析在癌细胞生长中发挥重要作用的MAPK-ERK和PI3K-AKT信号通路是否参与TRPC3通道调节癌细胞的生长，以及抑制TRPC3通道是否会影响EMT标志分子表达。最后，我们用非小细胞肺癌患者组织芯片上验证是否TRPC3分子在间质状态癌组织上表达增高以及与患者临床信息有无关系。为鉴定TRPC3通道分子作为癌组织发生EMT的NSCLC患者的治疗靶分子提供实验依据。　　研究目的:　　(1)选用永生化的人类支气管上皮细胞16HBE和非小细胞肺癌细胞A549、H460、H1299和95D，用Western-blot检测上皮细胞标志蛋白E-钙粘连蛋白(E-Cadherin)和间质标志分子波纹蛋白(vimentin)的表达，鉴定这些细胞系的上皮和间质状态状态。　　(2)在5个细胞系，用real time RT-PCR检测TRP通道分子mRNA的表达变化，包括有TRPM1，TRPM7，TRPM8，TRPC1，TRPC3，TRPC4和TRPC6。在转录水平检测TRPC3在间质和上皮两种状态间存在表达差异，同时鉴定其他与癌症相关的TRP通道是否也有相似变化。在此基础上，用Western-blot检测在两种状态癌细胞间存在差异的TRPC3蛋白表达水平，并进行细胞内表达定位检测。　　(3)构建发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）质粒，稳定转染癌细胞，下调TRPC3通道分子表达，和用特异阻断剂抑制通道来检测该通道对癌细胞体外增殖，周期及相关周期蛋白表达，和癌细胞转移的影响，以及对用刺激物诱导细胞外的钙离子内流的影响。　　(4)抑制TRPC3通道，检测MAPK-ERK和PI3K-AKT通路中ERK和AKT蛋白磷酸化，鉴定TRPC3通道是否影响这两条信号通路。并进一步用抑制剂分别或联合阻断MAPK-ERK和PI3K-AKT通路，分析细胞周期。鉴定TRPC3通道影响癌细胞生长的作用中是否有这两条通路的参与。　　(5)用裸鼠成瘤实验进一步检测通道抑制后对癌细胞在皮下成瘤生长，及瘤体组织中相关信号通路分子磷酸化、周期蛋白、EMT标志分子E-Cadherin和vimentin表达的影响。　　(6)检测NSCLC病人组织E-Cadherin、vimentin和TRPC3通道分子的表达。根据上皮和间质标志分子表达水平将病人组织分为上皮状态癌和间质状态癌，分析通道分子表达水平在两类状态癌组织的差异。并与病人的临床资料做进一步统计分析，寻找与癌症恶性有关的信息。　　研究方法:　　(1)细胞系鉴定:实验中应用的非小细胞肺癌细胞系A549、H460和H1299在美国菌种保藏中心(ATCC)网站上有原始细胞系的短串联重复序列(short tandemrepeat，STR)图谱，我们将这三株细胞送南方医科大学法医鉴定中心做STR测序，与原始图谱比对，鉴定细胞是否有错误识别和交叉污染。　　(2)化学合成shRNA序列，用pSilencerTM puro试剂盒中提供的载体构建干扰质粒，电穿孔转染H1299细胞，嘌呤霉素筛选建立稳定干扰癌细胞株(shNC，shC3il和shC3i.2)。　　(3)用实时定量RT-PCR检测细胞TRP通道的mRNA相对表达量，以及鉴定稳定转染shRNA质粒的H1299细胞TRPC亚家族成员的mRNA表达状况。　　(4)用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞系和裸鼠肿瘤组织的上皮和间质标志分子、各细胞系中TRPC3基础表达量和干扰后蛋白表达水平、周期蛋白的表达，以及磷酸化ERK和AKT蛋白。　　(5)用细胞免疫荧光法检测TRPC3通道分子在细胞中表达定位。　　(6)细胞增殖实验:用噻唑蓝比色法(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium Bromide，MTT）检测癌细胞增殖及在阻断或干扰目的TRPC3通道情况下对增殖的抑制作用。用软琼脂克隆形成实验检测通道抑制对癌细胞恶性增殖的影响。　　(7)细胞周期检测:用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染细胞核，流式细胞仪检测目的TRPC3通道抑制对细胞周期进程的影响。　　(8)细胞钙内流实验:用绿色荧光染料Fluo-4/AM染色细胞内外钙离子，钙内流影像图用FV10-ASW1.7 viewer软件在激光共聚焦显微镜下记录。　　(9)裸鼠成瘤实验:5-7周龄裸鼠皮下注射1×107个细胞，检测成瘤的大小和重量来反映TRPC3通道抑制对癌细胞活体成瘤的能力和生长的影响。　　(10)癌细胞转移实验:用伤口划痕实验和Transwell小室转移实验来鉴定抑制TRPC3通道对癌细胞转移能力的影响。　　(11)人类NSCLC组织芯片检测:用免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)检测组织上E-cadherin，vimentin和目的TRPC3通道分子表达水平。根据染色深度和染色细胞比例判断染色等级。用E-cadherin和vimentin表达将癌组织分为上皮型和间质型两类，比较两类癌组织中TRPC3高表达的比率。　　(12)统计分析采用SPSS13.0统计分析软件进行数据资料的统计分析。对于计量数据资料用Shapiro-Wilk法进行数据的正态性检验，符合正态分布计量资料均用均数士标准差描述。两样本均数比较采用独立样本t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用q检验。计数资料率之间比较采用卡方检验，间质和上皮状态癌组织患者资料与TRPC3通道表达水平之间关系分析采用Fisher确切概率法。所有统计分析均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。　　研究结论:　　(1)检测上皮和间质细胞的标志分子来鉴定细胞系的状态。支气管上皮细胞16HBE为对照，4个癌细胞系中A549表达上皮标志分子，未见间质标志分子表达，为上皮状态癌细胞;H460、H1299和95D上皮标志分子表达缺失，为发生EMT的癌细胞，其中H1299和95D细胞间质标志分子表达阳性。　　(2)对细胞系TRP通道mRNA表达量检测。结果显示TRPC3表达在癌细胞系相对16HBE细胞增高，其中以间质标志分子表达阳性的H1299和95D细胞表达水平最高。其他TRP通道分子未见与癌细胞EMT有相似变化。而TRPC3通道蛋白在上述两个间质状态癌细胞表达亦增高。　　(3)体内外实验结果表明阻断TRPC3通道对间质状态的H1299细胞增殖有抑制作用，可能是通过抑制胞外的钙离子内流，调节AKT和ERK生长信号通路，抑制cyclin D1表达，使癌细胞不能顺利通过G1期，从而影响细胞DNA复制和倍增。　　(4)瘤体组织细胞的上皮和间质标志分子检测结果表明抑制TRPC3通道并不能直接逆转癌细胞已经发生的EMT，但阻断通道能中等程度抑制间质标志分子vimentin表达。另外，与EMT相关的癌细胞转移特性，我们发现阻断TRPC3通道后，癌细胞的转移都受到一定程度的抑制。　　(5)NSCLC患者组织检查结果表明TRPC3通道在间质状态癌组织相对上皮状态癌组织中表达增高，而且与该类型癌症患者的病理分级相关。　　(6)在细胞系和癌症组织，TRPC3通道分子都在间质状态癌的表达增高，抑制该通道使细胞阻滞在G0-G1期，细胞生长受抑制，而且能中度下调间质标志分子的表达，抑制癌细胞转移。这些结果都表明TRPC3通道是间质状态NSCLC癌细胞的生长相关分子，或许能作为此类型肺癌患者治疗的目的分子。