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N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate Receptor,NMDAR,NR)是离子型兴奋性氨基酸受体的一种类型,该受体具有生理学和病理学双重作用,不仅与兴奋性突触传递、突触可塑性、学习和记忆等许多中枢活动密切相关,而且NMDA受体过度激活所介导的神经兴奋毒性与许多常见的神经、精神疾患,如脑出血、脑肿瘤及脑外伤等引起的癫痫、抑郁、痴呆等有密切关系。 鉴于NMDA受体在生理和病理状态下的双重作用,通过选择性干预NMDA受体活动,可为相关致死、致残性疾患提供有效的治疗手段。已有的NMDA受体拮抗剂或阻断剂均为人工合成的小分子药物,能弥散通过血脑屏障(空间窗过大),作用选择性低,病变脑区及非病变脑区都会受到影响,而且由于神经元可逆性损伤的“时间窗”极短,人们难以适时使用有效的神经保护药物,这些均导致已有的药物难以进入临床。因此,人们开始探讨新的抑制NMDA受体功能的方法,其中,保护疫苗的应用有望成为中枢神经系统兴奋毒性脑损害免疫防治的新策略。本实验利用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化出针对NMDA受体主亚基NR1PreM1片段的R1JHL单克隆抗体,利用噬菌体展示技术分析NMDA受体表位,为表位疫苗免疫干预防治兴奋毒性脑损害策略的实<WP=5>施提供实验基础。主要内容如下:一.R1JHL单克隆抗体的制备及纯化:常规复苏R1JHL杂交瘤细胞,将处于对数生长期的R1JHL杂交瘤细胞以5×105细胞/鼠注射至经不完全福氏佐剂处理的BalB/C小鼠腹腔内诱生腹水,抽取腹水,离心、过滤后加0.02% NaN3 4℃保存。制备Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析柱进行抗体纯化,15%SDS-PAGE鉴定抗体纯化程度。提取大鼠脑组织膜蛋白,以纯化后的R1JHL单克隆抗体作Western-Blot分析,结果R1JHL单克隆抗体可特异性识别大鼠脑组织膜蛋白中115KD的NR1亚单位蛋白。二.NMDA受体主亚基NR1抗原表位确定:用纯化的R1JHL单克隆抗体(识别位点位于NR1膜蛋白PreM1片段第341-561位氨基酸)以 100μg/ml包被96孔酶联板,筛选噬菌体展示随机12肽库,经过4轮的生物筛淘后,从第四轮随机挑取12个噬菌体克隆进行特异性ELISA检测,得到9个与R1JHL单克隆抗体特异性结合的克隆,提取噬菌体单链DNA测序,得到一个阳性克隆序列HYNLSSDRKVRL,与R1JHL单克隆抗体识别序列相比,二者存在一致性序列DRK,提示DRK有可能为NR1膜蛋白PreM1片段上的一个B细胞表位。综上所述,我们用将R1JHL杂交瘤细胞腹腔注射BalB/C小鼠体内诱生腹水,采用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化R1JHL单克隆抗体,经15%SDS-PAG、Western-Blot鉴定后,证明该单抗具有高度特异性;利用该单克隆抗体筛选噬菌体展示随机肽库,得到一个与R1JHL单克隆抗体识别序列相一致的序列DRK,为进一步确定NR1膜蛋白PreM1片段上R1JHL单克隆抗体识表位及表位疫苗免疫干预防治兴奋毒性脑损害策略的实施提供了重要的实验依据。