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目的研究Th17细胞和Treg细胞在原发性肝癌(primary hepatic carcinoma, PHC)患者中的表达情况,探讨在PHC中是否存在Treg和Th17的平衡以及Th17、Treg和Treg/Th17与原发性肝癌病理发展的关系；研究Th17细胞、Treg细胞和肿瘤细胞在肿瘤微环境中的相互作用,探讨肿瘤微环境中相关细胞因子和细胞直接接触作用(包括共刺激分子和T细胞第一信号等)对Th17细胞和Treg细胞的作用,以期探索Th17细胞、Treg细胞和肿瘤细胞在肿瘤微环境中的相互作用机制。方法采用流式细胞仪分析的方法测定93例PHC患者外周血中Th17和Treg的比例分布状况,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)的方法检测外周血中Th17细胞和Treg细胞分化增殖相关的因子IL-1R、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23p19、TGF-β、RORc和Foxp3 mRNA水平的表达。分析研究对象的相关临床资料,包括：性别、年龄、术前甲胎蛋白(AFP)浓度、肿瘤直径、肿瘤个数、是否有门静脉癌栓、是否出现远处转移等等指标,探讨PHC患者外周血Th17细胞和Treg细胞比例分布与研究对象各项临床指标间的关系。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色法,分析炎性细胞在原发性肝癌患者肝组织的浸润情况。采用带有荧光标记的抗体进行免疫组织化学染色,直观分析Th17细胞和Treg细胞在原发性肝癌患者肝脏组织的分布。分离出CD4+T细胞、CD4+ CD25+ Treg:细胞、CD4+ CD25+T细胞、肿瘤细胞、非肿瘤细胞(为排除CD14+单核-巨噬细胞的影响,从肿瘤细胞和非肿瘤细胞中分离除去CD14+细胞),以直接接触和transwell小室隔离的方法进行细胞培养。用流式细胞仪检测肿瘤细胞和非肿瘤细胞胞膜上共刺激分子CD80、CD86和ICOSL (CD275)等的表达,并以相应的中和抗体进行阻断,观察阻断后Th17细胞和Treg细胞的变化。为排除细胞直接接触中细胞因子的作用,肿瘤细胞经150 gray的γ射线照射致死,不再分泌细胞因子,仅仅提供细胞直接接触作用。研究中统计分析采用SPSS 16.0软件。结果93例PHC患者外周血标本中Th17、Treg数量以及Treg/Th17明显高于正常对照组(4.621%±1：0.856% vs3.148%±0.716%,P<0.0001；8.618%±1.939% vs 4.967%±1.075%,P<0.0001;1.878%±0.402% vs 1.621%±0.315%,P<0.0001),且差异具有显著统计学意义(P<0.0001)。Th17细胞与Treg细胞呈正向直线关系(r=0.5132,P<0.001)。多元线性回归分析发现,PHC患者外周血中Th17、Treg数量与患者TNM分期密切相关联系(t=2.494, P=0.015; t=2.261, P=0.027)。PHC患者不同TNM分期(Ⅰ期11例、Ⅱ期28例和Ⅲ期40例、Ⅳ期14例)外周血中Th17细胞、Treg细胞数量以及Treg／Th17比值不同(Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期；Th17细胞：4.07%±0.746%<4.286%±0.7%<4.867%±0.84%<5.02%±0.87%；Treg细胞：6.767%±1.283%<7.934%±1.452%<9.155%±1.840%< 9.97%±1.974%; Treg/Th17:1.694±0.375< 1.865±0.325< 1.880±0.393<2.059±0.535)；将Ⅰ期和Ⅱ期称为早期阶段,Ⅲ期和Ⅳ期称为进展阶段也就是晚期,其中早期和晚期阶段的Th17和Treg细胞数量在统计学上有显著差异(Ⅰ期-Ⅱ期<Ⅲ期-Ⅳ期；Th17:4.225%±0.710%< 4.907%±0.843%; Treg:7.605%±1.489%<9.366%±1.891%；P<0.001)；而Treg与Th17的比值虽然晚期高于早期(1.817±0.344<1.926±0.436)但在本研究中早晚期之间相比较却无统计学差异(P>0.05)。激光共聚焦显微镜观察到Th17细胞和Treg细胞在肿瘤局部的聚集。肿瘤组织分离得到的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),非肿瘤组织分离得到的非肿瘤浸润淋巴细胞(NIL),Th17细胞和Treg细胞比例在TIL中高于NIL(P<0.05),高于自身外周血中Th17和Treg百分比(如：Th17:18.99%>6.70%>4.83%; Treg:19.48%>9.25%>5.28%)。分离得到的CD4+T细胞与自身肿瘤细胞和非肿瘤细胞共培养后,发现肿瘤细胞可以促进Th17细胞和Treg细胞增多。进一步将CD4+T细胞与自身肿瘤细胞以直接接触或以transwell小室隔离的方式共培养,发现Th17细胞和Treg细胞均增多,但直接接触的培养方式的促进作用更强。在transwell小室隔离共培养体系中,单独或联合加入IL-23p19、IL-6和TGF-β中和抗体作用后,Th17细胞出现不同程度的下降,阻断TGF-β后Treg细胞出现小幅度的降低；在细胞直接接触共培养体系中,单独或联合加入CD80、CD86和ICOSL(CD275)中和抗体作用后,Th17细胞出现不同程度的下降,但阻断后Treg细胞反而出现不同程度的升高。经150 gray的γ射线照射致死的肿瘤细胞仍然可以促进Th17细胞和Treg细胞的增高。分离纯化的CD4+ CD25+ Treg细胞与肿瘤细胞共培养后,可以检测出CD4+IL-17+Th17细胞；CD4+ CD25-T细胞与自身肿瘤细胞共培养后可以检测到CD4+ Foxp3+ Treg细胞。结论原发性肝癌外周血中Th17和Treg比例分布与肿瘤TNM分期密切相关,而且Th17和Treg的百分比随TNM分期增加而增加且成正向直线相关的关系,Th17细胞和Treg细胞比例在TIL中高于NIL,这或许说明Th17细胞和Treg细胞与肿瘤的发展密切相关、越高比例的Th17细胞和Treg细胞肿瘤越是恶化。Th17细胞与Treg细胞呈正向直线关系。肿瘤细胞可以通过分泌细胞因子和细胞直接接触的方式促进Th17细胞和Treg细胞的分化和增殖,而且在肿瘤微环境内,Treg细胞的表型会发生变化,部分可以表现为Th17细胞的表型,而且肿瘤细胞也会促使获得性Treg细胞的产生,使其具有Treg细胞的特征性表型。鉴于Th17、Treg细胞与肝癌的进展和预后的密切关系、考虑到Th17细胞、Treg细胞与肿瘤细胞的相互作用机制,除去或减少原发性肝癌肿瘤微环境中的Th17和Treg细胞,或许可以提高肿瘤的免疫治疗效果。