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目的:本研究在分子水平深入探讨肝细胞癌对索拉非尼的耐药机制,寻找能够有效预测其疗效的分子标志物,以提高治疗敏感性,避免无效或过度治疗,为开发索拉非尼的增敏方法和克服耐药提供新的途径。方法:1.采用浓度梯度递增法建立HepG2索拉非尼耐药细胞模型并利用Affymetrix表达谱芯片筛选耐药相关基因。2.利用Real time qPCR技术检测耐药相关基因在HepG2耐药细胞中的内源性表达和高内涵筛选影响细胞增殖的关键耐药相关基因。3.构建并制备RPL28基因RNA干扰慢病毒载体,感染HepG2索拉非尼耐药细胞后利用Real time qPCR和Western Blot技术检测其对RPL28基因表达的敲减效率。同时,利用Celigo计数检测细胞生长,Caspase3/7实验和流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,对比干扰表达前后细胞增殖、凋亡及周期状态的变化,初步探讨RPL28基因在肝细胞癌索拉非尼耐药中的作用及相关细胞学机制。4.采用Morris Hepatoma肝癌大鼠模型进行索拉非尼耐药体内研究,Real time qPCR和免疫组化检测RPL28基因在索拉非尼敏感期和耐药期的表达差异,同时免疫组化检测肿瘤增殖、凋亡及周期蛋白表达变化,进一步验证RPL28基因是造成索拉非尼耐药的关键基因。结果:1.采用浓度梯度递增法成功建立HepG2索拉非尼耐药细胞模型,IC50为9.988μM,耐药指数为5.97。利用Affymetrix表达谱芯片技术筛选出35个上调的耐药相关基因,同时推测这些基因调控FXR/RXR（Liver X receptor/Retinoid X receptor,肝X受体/视黄醛X受体）、p53等信号通路,并提示这些基因在血细胞的聚集和脂质代谢等功能中发挥作用。2.35个耐药相关基因在HepG2耐药细胞的内源性表达检测结果显示,有32个耐药相关基因在HepG2索拉非尼耐药细胞中的表达丰度均为高。其次,在32个高表达基因中,随机选择20个基因通过比较基因敲减对细胞增殖速度的影响,初步筛选出增殖抑制表型明显的基因,即关键耐药相关基因:RPL28和MAP4K3。再者,针对这2个基因的各3个RNA干扰靶点的质粒分别进行慢病毒包装和高内涵细胞增殖检测,进一步确认这两个基因影响增殖功能的具体作用靶点。最后,Real time qPCR验证各个单靶点的敲减效率。选择细胞增殖抑制最为显著（与对照组相比达到2.76倍）以及敲减效率也最高（与对照组相比达到86.1%）的RPL28-1靶点为关键耐药基因的作用靶点继续进行后续的细胞功能学研究。3.以RPL28-1靶点为模板,制备RNA干扰慢病毒载体并进行PCR和测序鉴定。将制备好的RNA干扰慢病毒载体进行RNAi慢病毒包装并感染HepG2索拉非尼耐药细胞,感染效率达到80%以上。利用Real time qPCR在mRNA水平检测RPL28基因的敲减效率,Western Blot检测靶点降低RPL28基因的外源蛋白水平表达,结果均表明敲除RPL28-1靶点对RPL28基因的外源表达有敲减作用,证明RPL28-1是有效的干扰靶点。Celigo细胞计数检测生长发现敲减RPL28基因的HepG2索拉非尼耐药株细胞的增殖速率受到显著抑制;Caspase3/7检测显示敲减RPL28基因的HepG2索拉非尼耐药株细胞的Caspase3/7活性增加,凋亡细胞增多;流式细胞凋亡检测也显示,敲减RPL28基因的HepG2索拉非尼耐药株细胞凋亡率增高;细胞周期检测结果显示,敲减RPL28基因的HepG2索拉非尼耐药株细胞处于S期的细胞增多,处于G2/M期的细胞无显著变化,处于G1期的细胞减少,提示RPL28基因与HepG2索拉非尼耐药株细胞的细胞周期显著相关。4.采用大鼠肝癌细胞株Morris hepatoma 3924A成功建立ACI大鼠原位肝癌模型进行索拉非尼耐药体内研究,Real time qPCR和免疫组化检测RPL28基因表达结果显示:相对于敏感期,耐药期大鼠RPL28基因mRNA和蛋白表达水平均升高。同时,免疫组化结果也显示:相对于敏感期,耐药期大鼠Ki-67和CDK4蛋白表达水平升高。以上结果进一步验证RPL28基因是造成索拉非尼耐药的关键基因。结论:MAP4K3和RPL28基因是索拉非尼的关键耐药相关基因。其中,RPL28基因通过增殖、凋亡和调控细胞周期等途径造成肝细胞癌对索拉非尼耐药。