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纳米磁诱导人肝癌Hep6细胞凋亡实验与影像学研究 研究背景 利用纳米技术对恶性肿瘤早期诊断和治疗是生物技术领域最前沿的研究课题。迄今在细胞模型已取得重大研究进展，可能成为继放疗、化疗、手术之后治疗癌症和基因疾病更有效的新方法。它涵盖纳米材料学，构成药物载体平台，与基因、靶物质组装技术，通过纳米生物传感器在肿瘤细胞表达，纳米装载抗癌基因或抗癌药物，实现抑制肿瘤细胞增殖、诱导和加速细胞凋亡目的。 研究意义 1、寻找癌细胞表面配位子特异性更强靶向物质，减少正常组织损害。2、寻找适宜纳米材料与之对应的制备新工艺，提高装载量、安全性和稳定性。3、检测纳米药物的肿瘤疗效。 基于上述思考寻找一种安全有效，消触癌灶的局部治疗新方法，尝试利用纳米技术，将磁性纳米材料包被表阿霉素，制成纳米磁性药物，实验诱导人肝癌Hep6细胞凋亡，了解对肝肿瘤的凋亡效果。本研究希望在体外细胞和动物实现诱导肝癌细胞凋亡，为肿瘤治疗提供新方法，也为下一步的临床应用提供可行性依据。 1 基础研究 1．1 纳米磁包被表阿霉素制备与药理学研究（纳米磁） 1．1．1 材料和方法：与广州军区总院药学部和中山大学纳米研究所共同参与下完成。工艺依赖包装药物表阿霉素与聚合体的理化特性，调节颗粒大小。采用PLGA（PLGA 50：50．100nm）聚酯制备程序，超速离心得沉淀物（纳米磁粒子）。包被关键技术是在氨基酸的阴离子条件下与药物偶合。载药量达到50％左右，缓慢释放约物。纳米磁是铁磁材料，将表阿霉素与聚乙酸—聚乙醇酸装载或与氨基酸阴离子形成共聚物，在PH3对表面特殊处理，与白蛋白或阴离子修饰耦合，增强其靶向性与特异性。结果：1、磁纳米粒形态学：磁纳米粒呈球型，平均粒径136±4.2nm（n=1000）。2、磁钠米粒体外降解，PLGA磁纳米粒的降解产物是寡聚乳酸、寡聚乙醇酸、乳酸和乙醇酸。3、纳米磁中表EPI体外释放，模型药物的包被不影响在纳米粒中的释放速度。4、纳米磁体内试验，纳米磁能明显地延长其在血液的存在时间。5、抑瘤实验结果，两组之间存在显著差异（P＜0.02）。结论：1．Fe3O4磁粉粒径小（9.6±1.2nm），具有超顺磁性，在磁场中具有较强的磁响应性。纳米粒靶向部位，施加电磁辐射，磁性材料会吸收能量辐射热能，局部靶区组织升温，第二军医大学博士毕业论文 杀伤肿瘤组织。 1.1.2.纳米磁能均匀地混悬于溶液中，被转运到机体组织、器官发挥抗肿瘤作用。 1.1.3.体内、体外试验表明PLGA磁钠米粒可以生物降解，对组织、细胞无毒，具 有生物安全性。EPI磁性PLGA纳米粒符合人体应用要求。总之，纳米磁具有（l） 超顺磁缓释性;（2）靶向输送:（:3）生物安全性。， 1.2纳米磁诱导肝癌Hep6细胞刁司一1二夕。Llill}了口!究 材料和方法:1) HEP肝癌细胞培养和裸鼠侈捉!瘤（料只）。2)]’‘州军区总院药学 部与中山大学纳米研究所研制完成纳米磁包被Epl。3)细胞实验经过纳米磁诱导 细胞凋亡，采用双标记方法（AnnexinV爪I）对凋亡细胞进行定量、定性、DNA测 量，以及检测凋亡率。3、裸鼠荷瘤实验（包括兔vxZ、C57小鼠）实体瘤分三组: 纳米磁低浓度组3mg/ml，纳米磁高浓度组smg/ml，对照组为生理盐水，每组8 只，用药后4一5周。经光镜、病理、和电镜观测凋亡超微结构。结果:l)细胞学 结果:纳米磁作用HeP6细胞;24h实验组:凋亡率由30%升至60%;36h三组结果 分别为53%，78%，2%;组间差异显著（t=3 .05，P=0 .019）。凋亡率与药量、时间 呈正相关（r=0 .96，P<0.05）。2)电镜:肿瘤中心坏死以NEPI组为最高。中心区大片 细胞坏死;交界区部分细胞坏死一与凋亡共存;边缘区少量凋亡。3)实体瘤与电镜 病理:肿瘤分三区，NEPI组的中心区见大片粱状凝固坏死:交界区见大量细胞凋 书一与凋亡小体;边缘区见散发凋I’，毛峥.)!如tll介介·稀少，炎细胞包}同.，药物对照组: 中心区小片状坏死;交界区少量凋亡。NIi}’!组的其他器官均未见肿瘤转移。对照 组中大部分发生肺与肝转移灶（6/8只）。组间结果差别显著（F=8 .748，P<0 .029）。 结论:纳米磁能有效杀伤HCC细胞，其效率与浓度、时间成正相关。纳米磁有明 显的阻止肿瘤生长，明显的抑制肿瘤血管和转移。 2.影像学研究部分 采用不同影像方法对比研究纳米磁作用下裸鼠（c57、vx，）Hcc细胞凋亡意义。1、目的:应用影像学不同手段比较观察肿瘤变化的敏感性，提供非创伤性评价纳米磁作用于裸鼠HCC凋亡方法。材料和方法:采用超声、CT、MRI方法与病理学对照比较学研究，评估经纳米磁与表阿霉素对治疗的肝癌Hep6裸鼠移植瘤的抑瘤作用。分三组;EPI组，Ep工组，空自对照组.娜组8只。，主要解决消融治疗后的肿瘤残留的大小，对消融治疗:1个区J或进寻。J:犷11.点l，.‘有!r，I之IJ:，:J}‘I，所川‘心的去血管区;第二军医大学博士毕业论文b.交界区，凋亡发生主要区;c.边缘区，肿瘤细胞凋亡极少区域。每组均进行CT、MRI、B超检查。前者还进行增强检查。结果1、裸鼠CT时间一密度曲线（TDc）:EPI组在TDC动脉早期CT值40HU，EPI组为52HU，对照组为59HU，三组间差异显著 (P<0