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目的:
1、研究重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibrio vulnificus hemolysin,rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein edndothelial cells,HUVEC)凋亡及其通路。
2、研究rVvhA诱导小鼠单核巨噬细胞(J774A.1)凋亡及其通路。
3、进一步探索创伤弧菌溶细胞素(vibro vulnificus hemolysin,VvhA)的致病机制。
方法:
1、诱导含pET-28a(+)whA重组质粒的BL21大肠杆菌表达VvhA。应用Ni2+-NTA亲和层析方法对rVvhA进行纯化；复性液结合分步透析法复性后,利用绵羊红细胞测定其溶血活性。rVvhA冷冻干燥成粉末于-70℃保存。1溶血单位(HU)为使红细胞悬液中的血红蛋白释放一半所需要的rVvhA量。
2、不同浓度rVvhA作用HUVEC和J774A.1,MTT法检测rVvhA对细胞生长的抑制作用；普通光学显微镜观察细胞的形态变化,透射电镜进一步观察细胞和线粒体的超微结构；Annexin V-FITC/PI标记法结合流式细胞仪检测HUVEC和J774A.1凋亡或坏死的情况；流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化；分光光度法检测caspase-3,-8,-9的活性；激光共聚焦检测凋亡诱导因子(apoptosis induse factor,AIF)分布的改变；caspase-3、caspase-9的抑制剂(Ac-DEVD-FMK,Ac-LEHD-FMK)对细胞凋亡率及分别对caspase-3、caspase-9活性影响。
结果:
1、含pET-28a(+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌经0.5 mmol/L IPTG诱导后表达的融合蛋白Mr约为54 kDa,SDS-PAGE结果与该融合蛋白的理论推算值相符。表达的蛋白质经三步洗涤后,再经Ni2+-NTA柱纯化,其纯度达93％左右。纯化的rVvhA经复性液复性后,溶血活性为0.2 mg蛋白/HU。
2、MTT结果显示,rVvhA对HUVEC的生长抑制具有剂量依赖性。3.0 HU/mlrVvhA的抑制率是52.4％。其中3.0、4.0 HU/ml rVvhA作用HUVEC8 h:细胞和线粒体形态都有凋亡的改变；凋亡率分别达到(12.83±5.00)％、(51.73±1.96)％；流式细胞仪结果显示线粒体膜电位降低,绿色荧光率分别是12.0％、19.0％。4.0 HU/ml rVvhA诱导HUVEC凋亡的过程中,caspase-3、caspase-9活性随时间逐渐增高,而caspase-8没有明显变化。caspase-3抑制剂Ac-DEVD-FMK和caspase-9抑制剂Ac-LEHD-FMK使细胞的凋亡率分别下降到(14.2±3.47)％、(24.93±3.93)％；相应地caspase-3、caspase-9活性也降低。激光共聚焦未观察到AIF分布位置的改变。
3、MTT结果显示,rVvhA抑制J774A.1细胞生长也具有剂量依赖性。2.0、3.0HU/ml rVvhA作用J774A.18 h,细胞和线粒体形态都有凋亡的改变；凋亡率分别达到(7.8±0.62)％、(12.33±0.12)％,均高于对照组(3.07±0.67)％；线粒体膜电位也下降,流式细胞仪结果显示绿色荧光率分别是9.8％、39.2％。其中3.0 HU/ml rVvhA处理组,caspase-3、caspase-9活性增加,并且具有时间依赖性,而caspase-8活性没有明显改变。3.0 HU/ml rVvhA加caspase-3抑制剂(Ac-DEVD-FMK)或caspase-9抑制剂(Ac-LEHD-FMK)的凋亡率与3.0HU/ml rVvhA处理组相比都降低,分别为(6.23±3.95)％、(9.6±3.14)％；同时相应地caspase-3、caspase-9活性也下降。激光共聚焦未观察到AIF位置的改变。
结论:rVvhA具有诱导HUVEC和J774A.1细胞凋亡的生物学活性；其机制可能与线粒体途径有关。