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奶牛子宫内膜炎是一种奶牛产后的常见病,一定程度上影响着奶牛的产奶量,同时还会造成奶牛不孕,甚至死亡等问题的发生,给奶牛养殖场带来了极大的经济损失。其主要发病原因是病原微生物的感染,大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)为最主要致病菌。目前主要通过使用抗生素来达到治疗效果,但抗生素的大量使用,会使细菌产生耐药性,还会带来药物残留和食品安全问题,因此寻找一种可以替代抗生素的药物来预防和治疗奶牛子宫内膜炎具有重要意义。鼠李糖乳杆菌GR-1(Lactobacillus rhamnosus GR-1,L.rhamnosus GR-1)是从女性尿道中分离得出的一种无毒、无副作用的益生菌,可以稳定黏附在生殖道上皮细胞中,抑制致病菌的黏附和增殖,减少炎症的产生,但其在奶牛子宫内膜炎疾病上应用较少。细胞培养技术,具有高效性和经济性的优点,目前普遍通过该方法来研究大动物疾病。因此,本试验利用细胞培养技术,体外分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞(bovine endometrial epithelial cells,BEECs),通过E.coli感染BEECs,体外构建细胞炎性损伤模型,进而研究L.rhamnosus GR-1对其是否具有保护作用,并确定添加浓度和作用时间,为其临床应用提供理论依据。本试验中,采用健康未孕奶牛的子宫作为试验材料,通过改良后的组织块消化贴壁法,结合免疫组化荧光鉴定和细胞活力测定方法,成功分离培养出纯度较高并具有良好细胞特性和活力的BEECs。以不同浓度的E.coli诱导刺激BEECs,通过观察细胞形态、CCK-8、ELISA和Western blot等技术,探究E.coli引发炎性反应的最佳添加浓度和用时间。结果显示:当细胞与5 × 105 CFU/mL E.coli作用6h或与5 × 104 CFU/mL E.coli作用9h,IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的分泌情况与对照组相比显著升高(P<0.05),IκBα和p65蛋白磷酸化水平极显著升高(P<0.01),表明E.coli可以刺激BEECs产生炎性反应,成功建立奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤模型。以不同浓度的L.rhamnosus GR-1作用BEECs,通过观察细胞形态变化、CCK-8和ELISA等技术,探究L.rhamnosus GR-1对细胞是否具有危害作用。结果显示:细胞与5 × 107 CFU/mL L.rhamnosus GR-1作用9 h,细胞活性显著降低(P<0.05),仅TNF-α的分泌情况与对照组相比显著升高(P<0.05),细胞与5 × 106 CFU/mL L.rhamnosus GR-1作用12h,细胞活性显著降低(P<0.05),IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的分泌情况与对照组相比无显著性差异,细胞与5 × 105 CFU/mLL.rhamnosus GR-1作用12 h,对细胞活性和炎性因子的分泌无影响,表明一定浓度的L.rhamnosus GR-1对BEECs无危害作用,确定L.rhamnosus GR-1的安全添加浓度和作用时间。采用提前3 h加入L.rhamnosus GR-1预处理BEECs的方法,通过观察细胞形态和ELISA技术,探究安全浓度的L.rhamnosus GR-1对以上两种炎性损伤模型是否具有保护作用。结果显示:5× 105 CFU/mL L.rhamnosus GR-1组IL-6和TNF-α的分泌情况与E.coli组相比显著降低(P<0.05),同时高于自身对照组,5 × 106 CFU/mL L.rhamnosus GR-1组IL-6和TNF-α的分泌情况与E.coli组相比极显著降低(P<0.01),同时高于自身对照组。表明提前3 h添加L.rhamnosus GR-1进行预处理对细胞具有保护作用,且当L.rhamnosus GR-1 添加浓度为 5 × 106 CFU/mL,E.coli添加浓度为 5 × 105 CFU/mL,共同作用6 h时保护效果最好。结论:改良后的组织块消化贴壁培养法,可以缩短细胞培养周期,提高细胞纯度和活性,获得稳定的BEECs;细胞与5 × 105 CFU/mL E.coli作用6 h或与5 × 104 CFU/mL E.coli作用9 h可以产生炎性反应;细胞与5 × 1 06 CFU/mL L.rhamnosus GR-1作用9 h或与5 × 105 CFU/mL L.rhamnosus GR-1作用12 h无危害作用;提前3 h添加L.rhamnosus GR-1对细胞具有保护作用,且当L.rhamnosus GR-1添加浓度为5 ×106 CFU/mL,E.coli添加浓度为5 × 105 CFU/mL,共同作用6 h时保护效果最好,为最佳添加浓度和作用时间。