热休克蛋白60(heat shock protein, HSP60)是HSP家族的成员之一，生理状态下主要位于线粒体内，小部分位于胞浆。我们前期报道，心肌缺血时HSP60异常转位进入心肌细胞胞膜中并且出胞，异常出现在实验动物血清中。文献报道，外源性HSP60能够激活天然免疫细胞所表达的toll样受体（toll-like receptor, TLR）2和4，引起致炎细胞因子产生。TLR2和TLR4均为分布于细胞膜中的跨膜受体，配体结合区位于胞外，它们不仅在免疫细胞表达，也在心肌细胞及其他类型细胞表达。生理状态下，HSP60位于细胞内，不具备激活TLR2/4的条件；当心肌缺血时，内源性HSP60异常出现在胞外（例如血清），我们推测其有可能激活心肌细胞TLR2和/或TLR4受体从而诱导炎症反应，本课题检验了这一假设。为了验证该假设，本课题在正常培养的H9c2心肌细胞，研究了外源性HSP60的致炎作用以及TLR2/4信号机制；并且在H9c2心肌细胞模拟缺血模型以及整体大鼠心肌缺血模型，研究了缺血时异常出现在胞外的内源性HSP60对缺血所致心肌炎症反应的介导作用以及TLR2/4信号机制。【研究方法】培养细胞实验：按常规培养H9c2心肌细胞系，当细胞融合达80%时，给予外源性HSP60孵育，或者以“无血清+低糖+1%低氧”进行模拟缺血培养。ELISA法检测细胞培液上清HSP60含量，判断模拟缺血是否引起HSP60出胞；real-time RT-PCR法检测细胞TNF-α和IL-6mRNA含量，结合ELISA法检测培液上清TNF-α和IL-6含量，从而反映炎症反应情况。为了研究胞外HSP60引起炎症反应的信号机制，我们进行了三项检测：1）免疫共沉淀法检测HSP60与TLR2/4以及TLR2/4与其下游接头蛋白MyD88/Trif的结合情况；2）Western blot法检测TLR2/4下游信号分子p38、JNK和NF-κB的激活情况；3）利用药物阻断TLR2/4、MyD88、p38、JNK和NF-κB等信号分子，观察对外源性HSP60以及模拟缺血所致炎症反应的干预作用。整体动物实验：结扎冠状动脉左前降支（left anterior descending coronary artery,LAD）4h制备整体大鼠心肌缺血模型。ELISA法检测血清HSP60含量以反应胞外HSP60含量；real-time RT-PCR法检测心肌TNF-a和IL-6mRNA表达水平，ELISA法检测血清TNF-α和IL-6含量，以反应心肌炎症反应情况。为了研究胞外HSP60是否参与介导缺血心肌炎症反应，用免疫共沉淀法检测了心肌组织中HSP60与TLR2/4及其下游接头蛋白MyD88/Trif的结合情况，并且用抗体中和血清HSP60（胞外HSP60），观察能否减轻缺血心肌炎症反应。【结果】1.在培养的H9c2心肌细胞，外源性HSP60经TLR4-MyD88-p38/NFkB通路引起炎性细胞因子产生在常规培养的H9c2心肌细胞，外源性HSP60能够显著增加炎性因子TNF-α和IL-6的表达和释放。HSP60孵育后1h即有显著增加，孵育后6h后达到峰值。在孵育6h条件下，HSP605μg/mL处理组和HSP601μg/mL处理组TNF-α和IL-6表达和释放量均显著高于对照组，且前者更高。取外源性HSP60（1μg/mL）孵育6h后的细胞裂解液，用HSP60抗体和TLR4抗体分别进行免疫共沉淀，结果显示HSP60与TLR4有明显结合，但与TLR2基本没有结合；同时，TLR4与MyD88而不与Trif结合。在对照组细胞中，TLR4与MyD88有结合；在HSP60处理组细胞中，TLR4与MyD88结合明显增多。Western blot结果显示，外源性HSP60（1μg/mL）使得TLR4-MyD88下游的激酶p38和JNK均发生磷酸化激活，两者在HSP60孵育后1h即激活（P＜0.05），6~12h达到峰值（P<0.01）。免疫荧光染色和Western blot检测表明，外源性HSP60（1μg/mL）使得TLR4-MyD88下游的转录因子NF-κB的亚单位p65发生核转位，表明NF-κB被激活。以外源性HSP60（1μg/mL）孵育6h诱导炎症反应，TLR4siRNA（100nM）、TLR4抗体（5μg/mL）、MyD88抑制性多肽（100μM）、p38抑制剂SB203580（20μM）和NF-κB抑制剂PDTC（100μM）均能够显著抑制HSP60所致p38和JNK激活以及炎性细胞因子产生；但TLR2抗体（5μg/mL）和JNK抑制剂SP600125（20μM）无显著作用；阴性对照siRNA、对照抗体IgG和MyD88对照多肽也无显著作用。以上结果表明，外源性HSP60具有诱导心肌细胞产生炎性细胞因子的效应，该效应由TLR4-MyD88-p38/NFkB通路所介导，而与TLR2和Trif无关。2.在模拟缺血培养的H9c2心肌细胞，内源性HSP60异常出现在胞外，并经TLR4-MyD88-p38/NFkB通路参与介导缺血所致炎症反应H9c2细胞模拟缺血12h后，ELISA法检测到培液上清HSP60含量为3.7±0.7ng/mL，而对照组几乎检测不到，表明模拟缺血引起HSP60出现在胞外。免疫共沉淀法显示，在模拟缺血处理的细胞中，HSP60与TLR4有大量结合，但与TLR2基本没有结合；同时，TLR4与MyD88而不与Trif结合，模拟缺血组较对照组TLR4与MyD88结合量更高。在模拟缺血的H9c2心肌细胞，Western blot结果显示p38和JNK均发生磷酸化激活，用抗体中和胞外HSP60（anti-HSP60,10μg/mL）、用抗体封闭TLR4（anti-TLR4,5μg/mL）、或者用MyD88抑制性多肽（100μM）可显著抑制模拟缺血引起的p38和JNK激活。Real-time RT-PCR及ELISA结果显示模拟缺血引起TNF-α和IL-6表达和释放均显著增加，anti-HSP60、anti-TLR4、TLR4siRNA (100nM)、MyD88抑制性多肽、p38抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂PDTC能够显著抑制该效应，而JNK抑制剂SP600125无显著作用。该结果表明，在H9c2细胞，模拟缺血引起内源性HSP60异常出现在胞外，胞外HSP60经TLR4-MyD88-p38/NFkB通路参与介导缺血所致炎症反应。3.在整体大鼠心肌缺血模型，内源性HSP60异常出现在循环中，并经TLR4-MyD88通路参与介导缺血心肌炎症反应大鼠LAD结扎4h后，ELISA法检测到血清HSP60含量为8.3±1.5ng/mL，而假手术组基本检测不到，表明缺血引起HSP60在胞外出现。免疫共沉淀法显示，在缺血心肌中，HSP60与TLR4有大量结合，而与TLR2基本没有结合；同时，TLR4与MyD88而不与Trif发生免疫共沉淀，缺血组较假手术组TLR4与MyD88结合量更高。LAD结扎4h后，Western blot显示p38和JNK均显著激活。用抗体封闭血清中的HSP60（anti-HSP6020μg/kg，于LAD结扎15min前静脉注射），能够抑制p38和JNK激活，而对照抗体IgG没有显著效应。此外，心肌缺血引起TNF-α和IL-6产生和释放量均显著增加（P<0.01），anti-HSP60能够抑制该效应，而对照抗体IgG没有显著效应。【结论】本课题研究表明，外源性HSP60能够诱导心肌细胞产生炎性因子，该效应由TLR4-MyD88-p38/NFkB通路所介导，而与TLR2、Trif和JNK无关；当心肌缺血时，内源性HSP60异常存在于胞外，也能够激活心肌细胞TLR4-MyD88通路（不激活TLR2和Trif通路），从而诱导缺血心肌炎症反应。本课题发现“胞外HSP60”是缺血这一非感染性刺激引起心肌炎症反应的介导机制，为认识缺血心肌炎症反应的发生机制以及寻求干预措施提供了理论和实验依据。