ADSCs对超量肝切除术后残肝再生促进作用的实验研究

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[目的]探讨SD (Sprague Dawley)大鼠脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)的体外培养方法、生物学特性、体外诱导分化的能力,及其在SD大鼠超量肝切除模型中向肝细胞分化的情况,以此来探讨ADSCs对肝再生的促进作用。[方法]①取雄性SD大鼠腹股沟脂肪做原代培养,观察细胞生长情况、细胞形态、描绘细胞生长曲线。②取第Ⅲ代细胞,流式细胞仪鉴定细胞,并确定细胞纯度。③制备体外诱导条件培养液,取第Ⅲ代细胞制备细胞爬片,加入体外诱导条件培养液,每天观察细胞形态变化并于诱导后14、21d免疫组化检测Alb、CK18。④制备雌性SD大鼠超量肝切除模型,通过其门静脉属支注入雄性SD大鼠的ADSCs,术后1、7、14、21d取血查肝功能(AST、ALT、TB、Alb、TP),取14、21d组大鼠肝组织常规病理学检查HE染色及免疫组化检测Y染色体sry基因蛋白和Alb双阳性细胞及sry基因蛋白和CK18双阳性细胞。[结果]①原代培养后约第10天细胞长满培养瓶底,细胞为长梭形,呈成纤维细胞样或漩涡样生长;随着传代次数越多,细胞形态越单一;细胞生长曲线呈S型,第Ⅲ代细胞增殖能力最强。②流式细胞检测CD44表达率约98.5%,CD90表达率约92.6%,CD49d表达率约90.5%,CD29表达率约73.1%,CD45表达率约0.3%,CD34表达率约0.6%,并通过它们之间的相互组合证实此细胞为ADSCs,且纯度较高。③细胞爬片于体外诱导后第5天开始发生形态变化,由干细胞的长梭形逐渐变成肝细胞样的多边形、类圆形,且部分细胞出现肝细胞所特有的双核。免疫组化检测诱导后14、21d细胞爬片Alb和CK18的表达,其均呈阳性,且随诱导时间的延长阳性细胞数逐渐增多。④细胞移植后第21天实验组较对照组和阴性对照组ALT、AST显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);各时间点所测的TB实验组、对照组、阴性对照组三组间均无统计学差异(P>0.05);随着时间延长各组TP、Alb数值上先降低后升高,第21天实验组较对照组和阴性对照组TP、Alb显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化检测细胞移植后第14、21天肝组织,实验组Alb、CK18与Y染色体sry基因蛋白双染色细胞第14天表达呈阳性,第21天时阳性细胞数增多。[结论]①ADSCs可通过特殊的培养方法从脂肪组织中获得,且在体外培养时能够多次传代、大量扩增,而保持其生物学特性。ADSCs具有很强的增殖能力,且第Ⅲ代的增殖能力最强。②ADSCs能通过流式细胞仪检测其多种表面抗原及其相互组合而得到鉴定,通过本实验方法得到的ADSCs纯度较高。③在损伤肝脏条件培养液的诱导下ADSCs能分化为肝样细胞,表达肝细胞的标志且具有肝细胞的功能。④ADSCs在肝切除术后的肝再生环境中能分化为肝样细胞,表达肝细胞特有标志,具有肝细胞的功能,且有助于术后肝功能的恢复,从而对残肝再生有促进作用。
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