在长期的进化进程中,为抵抗病原生物进化出免疫系统。脊椎动物的免疫系统分为先天性免疫系统(Innate immunity)和获得性免疫系统(Acquired immunity)。Toll/IL-1受体超家族(Toll/IL-1 receptor superfamily)是由TLR家族和IL-1R家族组成。这个新受体家族中的成员都含有Toll同源结构域的TH结构域,是由含有128个氨基酸残基的10段保守序列组成的。这一信号通路成员是重要的模式识别受体,在对抗外来入侵病原体的天然免疫中发挥着重要的作用。MicroRNA(miRNA)是约含22核苷酸的内生非编码的小分子RNA,作为一类负转录调控因子,其可以调控基因的转录后水平。miRNA可以通过特定的结合位点与mRNA的3’非翻译区(3’UTR)通过不完全的互补配对方式引起该基因翻译受阻或者直接降解mRNA,在转录后水平调控基因的表达。在本研究中,通过鮸鱼转录组测序分析获得病原菌感染后的差异表达基因,并对差异表达的Toll/IL-1受体超家族中成员进行了miRNA调控研究,研究结论如下:1.我们通过对鮸鱼感染鳗弧菌前后的脾脏cDNA进行转录组测序,对照组(Ctrl)获得51,853,370条raw reads和感染组(Van)获得51,852,199条raw reads。通过与鮸鱼参考基因组序列进行比对筛选,对照组获得34,790,143条匹配的read,Van感染组获得34,526,606条匹配的reads,这些read组装成了47,971条unigenes。然后,对两组样本进行数字表达谱分析,获得差异表达的基因2,482个,其中上调的有1,313个。然后,根据这些差异表达基因的GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析,获得了一些与病原体感染后免疫相关的基因,其中包括Toll/IL-1受体家族的TLR1和IL-1R等,它们都是在鳗弧菌感染下表达量发生显著上调的基因。2.本研究发现,IL-1RI在鳗弧菌感染的鮸鱼脾脏组织及LPS刺激的鮸鱼巨噬细胞中的表达量都是显著升高的,进一步证实了IL-1RI在免疫及炎症反应中发挥作用。利用生物学信息学的方法,筛选出了可能与IL-1RI 3’UTR区域结合的miRNA,其中包括miR-192,并对其启动子进行了分析,预测出其可以被转录因子AP-1所调控。通过双荧光素酶报告基因实验发现miR-192可以抑制IL-1RI 3’UTR野生型报告质粒的荧光活性,但对突变型无作用,这证实miR-192对IL-1R的抑制效应是严格依赖于“Seed region”与IL-1RI mRNA之间的相互作用。荧光定量分析miR-192在鳗弧菌感染的脾脏组织和LPS刺激的鮸鱼巨噬细胞中的表达量变化与IL-1RI的变化趋势相反,从而进一步证实miR-192对IL-1RI表达的调节作用。3.本研究发现,TLR1在鳗弧菌感染的鮸鱼脾脏组织中的表达量是显著上升的。LPS是脂质和多糖的复合物,是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,对LPS刺激后的鮸鱼脾脏及LPS刺激后的鮸鱼巨噬细胞进行TLR1表达量的分析,发现其表达量是上调的。通过生物学信息学的方法及双荧光素酶报告基因筛选出miR-217可靶作用TLR1的3’UTR。通过miR-217可以抑制TLR1 3’UTR野生型报告质粒的荧光活性而对突变型无作用,验证了miR-217可以直接靶作用TLR1 3’UTR的“Seed region”。利用构建的miR-217前体质粒,通过双荧光素酶报告基因实验发现miR-217前体有类似于miR-217模拟体的活性也可以靶作用TLR1 3’UTR而抑制荧光活性。另外,荧光定量分析miR-217在LPS刺激的脾脏组织和LPS刺激的鮸鱼巨噬细胞中的表达量情况,结果显示其表达量是上调的,表明miR-217可能参与调节机体对LPS刺激的反应。