阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种进行性中枢系统神经退行性疾病，其主要病理特征是细胞外β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)聚集沉积形成的老年斑，细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结和神经元丢失。其中，Aβ在AD的发生发展中发挥关键的作用。研究发现其可通过下调脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)相关信号传导通路而导致神经元突触损伤，而引起神经元细胞凋亡、死亡，最终导致AD。虽然存在针对该假说提出的治疗方法，但是目前并未出现能有效治疗AD的药物。此外，这些药物存在一些问题，如：持续时间短、毒副作用大、来源困难及不易透过血脑屏障等。槲皮素-3-O-葡萄糖酸苷(Quercetin-3-O-glucuronide, Q3G)，作为一种黄酮类化合物，其具有良好的食品安全性及强大的抗氧化、清除自由基、抗衰老和抑制肿瘤细胞生长等活性。已有研究表明Q3G可通过抗氧化、抑制Aβ的形成发挥其神经保护作用，但Q3G是否通过调控BDNF相关信号通路来改善AD，国内外文献未见报道。本研究以Aβ1-42处理人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)于体外构建细胞损伤模型，探究Q3G对Aβ1-42致SH-SY5Y细胞损伤的改善作用，并在此基础上探究其具体的作用机制，从而为AD的防治提供新的依据与思路。本研究的主要内容包括以下两个部分：
　　第一部分Q3G对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
　　目的：本研究以Aβ1-42处理SH-SY5Y细胞于体外构建细胞损伤模型，探究Q3G对Aβ1-42致SH-SY5Y细胞损伤的改善作用。
　　方法：
　　(1)Aβ1-42对SH-SY5Y细胞损伤模型的建立
　　将SH-SY5Y细胞分为对照组和不同剂量(5、10、20、40及50μM)的Aβ1-42组，并分别干预12h、24h、36h及48h。采用CCK-8试剂盒(Cell counting kit-8, CCK-8)检测细胞活性，观察Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用，根据细胞活性选择Aβ1-42最适宜的剂量与时间。
　　(2)Q3G对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
　　在确定Aβ的剂量及时间后，采用同样的方法确定Q3G的剂量。将0、1、2、5、10、20、40及50μg/mL不同剂量的Q3G加入SH-SY5Y细胞中，1h后再添加20μMAβ1-42(实验组)或者0μMAβ1-42(对照组)。各组干预24h后，同样采用CCK-8检测细胞活性，观察Q3G对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，根据细胞活性选择Q3G最适宜的剂量。
　　(3)Q3G对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响
　　将SH-SY5Y细胞分为4组：对照组(仅添加不完全培养基)、Aβ组(20μMAβ1-42处理SH-SY5Y细胞)、Q3G+Aβ组(10μg/mLQ3G预处理SH-SY5Y细胞1h后，给予20μMAβ1-42)及Q3G组(10μg/mLQ3G处理SH-SY5Y细胞)。各组干预24h后，通过Hoechst33342/PI染色及AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡，以观察Q3G对Aβ1-42导致的细胞凋亡的影响。
　　结果：
　　(1)CCK-8实验结果显示，不同剂量的Aβ1-42均能导致细胞活性降低，并呈现明显的时间-剂量效应。与对照组(96.29±0.65%)相比，20μMAβ1-42作用24h后，细胞存活率明显下降(79.40±1.59%)，且差异具有统计学意义(P<0.05)；故选20μM作为Aβ1-42后续实验的干预剂量，24h作为干预时间。
　　(2)CCK-8实验结果显示，Q3G可抑制Aβ1-42诱导的细胞死亡，随着Q3G剂量的增加，细胞存活率也逐渐增高。当Q3G的剂量为10μg/mL时，细胞存活率最高，达到88.16±1.11%，且与Q3G为0μg/mL(78.95±1.61%)相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；20μg/mL、40μg/mL及50μg/mL浓度的Q3G也能缓解Aβ1-42对SH-SY5Y细胞的毒性作用，但与Q3G为0μg/mL相比，差异无统计学意义；故选10μg/mL为Q3G后续实验的干预剂量。
　　(3)Hoechst33342/PI染色结果显示，与对照组相比，Aβ组出现大量早期及晚期凋亡形态的细胞，Q3G处理后细胞凋亡数量明显减少。AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术结果提示，Aβ组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率明显较对照组增加，且差异具有统计学意义(P<0.01)；Q3G+Aβ组早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率较Aβ组明显下降，且差异具有统计学意义(P<0.05);Q3G组早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率较Aβ组也明显降低，且差异均具有统计学意义(P<0.01，P<0.05，P<0.01)。
　　结论：Aβ1-42的暴露可使SH-SY5Y细胞受损，导致细胞存活率降低，并促进细胞凋亡，而Q3G可改善Aβ1-42引起的细胞损伤。
　　第二部分Q3G对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞中BDNF表达的影响及其机制的研究
　　目的：本研究通过检测环腺苷磷酸反应元件结合蛋白(Cyclic-AMP response-element-binding protein, CREB)/BDNF蛋白表达水平及其上游关键的蛋白-蛋白激酶B(Protein kinase B, AKT/PKB)和细胞外调控蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)的磷酸化水平，探究Q3G对Aβ1-42致SH-SY5Y细胞损伤的改善作用的具体机制。
　　方法：
　　(1)Q3G对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞中BDNF信号通路相关蛋白表达的影响
　　将SH-SY5Y细胞分为4组：对照组(仅添加不完全培养基)、Aβ组(20μMAβ1-42处理SH-SY5Y细胞)、Q3G+Aβ组(10μg/mLQ3G预处理SH-SY5Y细胞1h后，给予20μMAβ1-42)及Q3G组(10μg/mLQ3G处理SH-SY5Y细胞)。各组干预24h后，提取细胞蛋白，采取蛋白质免疫印迹实验(Western blot, WB)检测BDNF通路相关蛋白的表达水平。
　　(2)抑制剂处理后，Q3G对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞中BDNF信号通路相关蛋白表达的影响
　　将SH-SY5Y细胞分为6组：对照组、Aβ组、Q3G+Aβ组、Q3G组、Q3G+LY294002(特异性PI3K/AKT通路抑制剂)+Aβ组(10μg/mLQ3G预处理SH-SY5Y细胞，30min后加入10μMLY294002抑制剂，再过30min后添加20μMAβ1-42)及Q3G+PD98059(特异性ERK通路抑制剂)+Aβ组(10μg/mLQ3G预处理SH-SY5Y细胞，30min后加入30μMPD98059抑制剂，再过30min后添加20μMAβ1-42)。各组干预24h后，提取细胞蛋白，采取WB检测BDNF通路相关蛋白的表达水平。
　　结果：
　　(1)各组细胞BDNF、p-CREB/CREB、p-AKT/AKT和p-ERK/ERK蛋白表达水平
　　与对照组相比，Aβ组BDNF蛋白的表达水平显著降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；调节BDNF基因表达的重要转录因子CREB的磷酸化水平(p-CREB/CREB)也相应降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；上游关键蛋白AKT及ERK的磷酸化(p-AKT/AKT及p-ERK1/2/ERK)水平明显降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)。与Aβ组相比，Q3G+Aβ组及Q3G组BDNF、p-CREB/CREB、p-AKT/AKT及p-ERK1/2/ERK蛋白的表达水平都明显增加，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　(2)抑制剂对各组细胞BDNF、p-CREB/CREB、p-AKT/AKT和p-ERK/ERK蛋白表达的影响
　　与Aβ组相比，Q3G+LY294002+Aβ组BDNF、p-CREB/CREB及p-AKT/AKT蛋白的表达水平均明显上调，且差异具有统计学意义(P<0.05)；但与Q3G+Aβ组对比，Q3G+LY294002+Aβ组BDNF、p-CREB/CREB及p-AKT/AKT蛋白的表达水平均明显下调，且差异具有统计学意义(P<0.05)。与Aβ组相比，Q3G+PD98059+Aβ组BDNF、p-CREB/CREB及p-ERK1/2/ERK蛋白的表达水平均明显上调，且差异具有统计学意义(P<0.05)；但与Q3G+Aβ组对比，Q3G+PD98059+Aβ组BDNF、p-CREB/CREB及p-ERK1/2/ERK蛋白的表达水平均明显下调，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　(1)Aβ1-42能明显下调SH-SY5Y细胞中BDNF、p-CREB/CREB、p-AKT/AKT及p-ERK/ERK蛋白的表达水平，而Q3G能上调上述蛋白的表达水平。
　　(2)Q3G可能通过上调p-AKT/AKT、p-ERK/ERK蛋白的表达水平，而促进CREB/BDNF的表达，发挥其保护作用。