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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是以母猪生殖障碍和各种日龄猪(尤其仔猪)的呼吸道症状为主要特征的急性、高度接触性传染病,该病病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。2006年之前我国主要的流行毒株是经典PRRSV,2006年出现了高致病性PRRSV(HP-PRRSV)感染和流行。目前,预防HP-PRRSV感染的主要措施是接种疫苗,疫苗的种类有JXA1-R、HuN4-F112及TJM-F92,其中,JXA1-R株应用最为广泛。本研究成功建立了 HP-PRRSV野毒及其疫苗毒株JXA1-R双重荧光RT-PCR鉴别检测方法,其主要研究内容如下:1.HP-PRRSV野毒荧光RT-PCR检测方法的建立根据GenBank中的经典PRRSV及HP-PRRSV野毒株全基因序列的比较结果,在HP-PRRSV nsp2基因设计了一对引物和一个探针,建立了 HP-PRRSV的荧光RT-PCR检测方法。该方法敏感性达4.43拷贝/μL,标准曲线相关系数为0.998;用三份不同稀释浓度的标准品对该方法的重复性和稳定性进行评估,该方法具有良好的重复性,组内变异系数为0.39%-0.96%,组间变异系数为1.1%-2.6%;用建立的方法同时检测经典 PRRSV、HP-PRRSV 野毒、PCV、PEDV、PRV、TGEV,只有 HP-PRRSV 野毒有特异性的荧光曲线,表明该方法的特异性好;该方法的检测灵敏度为普通RT-PCR的1000 倍。2.JXA1-R疫苗毒株荧光RT-PCR检测方法的建立根据HP-PRRSV与JXA1-R株的基因序列比较结果,设计一对引物和一个探针,建立了 JXA1-R株荧光RT-PCR检测方法。该方法灵敏度达8.25拷贝/μL,标准曲线相关系数为0.999;该方法的组内变异系数为0.42%-1.9%,组间变异系数为0.68%-2.74%,表明具有良好的重复性;用此方法对HP-PRRSV、经典PRRSV、PCV、PEDV、PRV、TGEV进行检测,均没有交叉反应,表明该方法的特异性好;并与常规RT-PCR做对比,灵敏度是其的1000倍。3.HP-PRRSV野毒及其疫苗毒株JXA1-R双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用在建立单一荧光RT-PCR检测方法的基础上,经过条件的优化,建立了鉴别检测HP-PRRSV和JXA1-R的双重荧光RT-PCR。该方法对HP-PRRSV和JXA1-R的检测灵敏度分别为4.43拷贝/μL和4.12拷贝/μL,对HP-PRRSV检测的批内重复性变异系数CV%最大值为0.70%,批间重复性变异系数CV%最大值为2.8%,对JXA1-R检测的批内重复性变异系数CV%最大值为0.62%,批间重复性变异系数CV%最大值为3.0%,均不超过5%,表明建立的方法重复性好;用此方法对经典PRRSV、PCV、PEDV、PRV、TGEV等进行检测,均没有交叉反应,表明该方法的特异性好。用建立的方法对临床200份血液样品进行了检测,HP-PRRSV荧光RT-PCR方法检测出32份阳性,阳性率为16%(32/200);JXA1-R疫苗毒株荧光RT-PCR方法检测出9份阳性,阳性率为4.5%(9/200);用双重荧光RT-PCR方法对这200份样品进行检测,结果与单一荧光RT-PCR方法检测一致,表明建立的方法具有很好的临床应用价值。