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大量研究表明动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性疾病。外周血单核细胞不断地迁入内皮下间隙是AS发生和发展过程中一个重要的早期事件,这一过程与大量趋化因子、黏附分子及生长因子的作用有关。其中血管细胞黏附分子-1(Vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)是一种重要的黏附分子,它参与介导了AS发生发展过程中单个核细胞的趋化、黏附并迁移入血管内皮下间隙的一系列过程。脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)是由肾上腺分泌的一种弱雄激素,其浓度在青春期达高峰而后随年龄的增加而迅速递减。据报道血中DHEA的水平降低与AS及其他心脑血管意外的发生有关,于是人们开始关注DHEA与一些衰老性疾病如AS发生发展的关系,已有研究发现DHEA具有抑制AS的作用,但关于其作用的具体机制还不十分清楚。本研究目的在于观察DHEA对AS模型动物及ox-LDL诱导的THP-1单核细胞中VCAM-1mRNA和蛋白表达的影响,从而探讨其抗动脉粥样硬化作用的可能机制。DHEA在体内主要是由细胞色素P450芳香酶降解为雌酮后发挥作用,维甲酸受体被激活后可通过Ⅰ.6启动子增强细胞色素P450的表达,因此本实验观察补充全反式维甲酸这一维甲酸受体激动剂能否特异性地增强DHEA抗AS的作用,以期为AS的防治提供新的实验依据。材料与方法一.动物模型构建与分组雄性新西兰大耳白兔40只,随机分为5组,各组动物在基础饲料中分别加入下列饮食喂养10周:①1%胆固醇+3%猪油;②1%胆固醇+3%猪油+0.25%DHEA;③1%胆固醇+3%猪油+0.25%DHEA+全反式维甲酸(0.6mg·kg-1·d-1);④0.25%DHEA;⑤正常饮食。二.动物血液生化指标检测各组动物喂养10周后禁食12 h,麻醉状态下取血约5ml,测定各动物血液生化指标水平,包括:总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。三.主动脉组织病理学观测分离各组动物的腹主动脉,固定后苏丹Ⅳ染色,肉眼观察AS病变情况并拍照。再常规包埋切片后行HE染色,观察组织学改变并测量各组动物主动脉斑块面积(μm2)、内膜厚度(μm)及中膜厚度(μm)等。四.细胞培养与分组以含10%胎牛血清的PRMI1640培养基悬浮培养THP-1单核细胞,并按实验计划随机分为7组:①正常对照组;②ox-LDL刺激组;③ox-LDL+低浓度DHEA组;④ox-LDL+中浓度DHEA组;⑤ox-LDL+高浓度DHEA组;⑥ox-LDL+DHEA+全反式维甲酸组;⑦单DHEA组。各组细胞在药物作用24h后按不同的实验方法收集和保存材料。五.免疫组织化学及免疫细胞化学固定后的各组主动脉标本石蜡包埋切片后按照SP试剂盒的说明进行染色,各组切片以HMIAS-2000高清晰度图像处理系统采集图像并分析。加药后生长状态良好的各组细胞均匀涂片,将乙醇和丙酮按照1:1的比例混合,固定细胞涂片20分钟后自然风干,常规免疫细胞化学SP法染色观察VCAM-1蛋白表达情况。六.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)冻存的主动脉标本及收集生长良好的各组THP-1细胞均采用Trizol一步法提取总RNA,取1μg产物进行逆转录合成cDNA并进行PCR。各组取10μlPCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。以SQ9636型扫描系统进行扫描并采用图像分析系统检测各组目的基因及内参的积分吸光度值,并以两者比值作为各组VCAM-1mRNA的相对表达量。七.统计分析各组数据采用SPSS12.0统计学软件进行分析,以均数±标准差(x±s)表示。多组间统计学差异显著性采用方差分析(ANOVA),组间两两比较采用t检验。以p<0.05表示差异有统计学意义。结果一.动物血液生化指标观察高脂模型组兔血清TC、LDL-C水平明显高于正常对照组,加入DHEA干预后LDL-C有所下降(p<0.05)。同时加入全反式维甲酸喂饲兔的TC、LDL-C水平又有进一步的降低(p<0.05)。二.主动脉病变大体观察正常对照组兔主动脉壁较薄且内膜光滑,无脂纹及斑块形成;高脂组兔主动脉内壁可见明显的红褐色脂质斑块附着,动脉壁明显增厚。DHEA干预组兔主动脉内膜也有脂质斑块附着,但与高脂饮食组兔相比斑块面积较小且分散。三.主动脉组织学观察及测量与正常对照组相比,高脂组兔主动脉内膜明显增厚内皮下间隙增宽,内膜下可见大量聚集的泡沫细胞。DHEA干预组兔主动脉内膜厚度及粥样斑块面积相对动脉粥样硬化模型组兔分别降低59%和48%,主动脉内膜下泡沫细胞聚集也较高脂组有所减轻。四. VCAM-1蛋白表达观察免疫组化染色后可见,VCAM-1蛋白在各组兔主动脉均有表达,表现为分布于主动脉内膜的棕黄色颗粒。高脂组兔主动脉内膜增厚明显并可见大量棕黄色颗粒沉积。DHEA干预组及加入全反式维甲酸组兔主动脉内膜厚度及棕黄色颗粒表达相对于高脂组均明显减弱。各组THP-1细胞经免疫细胞化学染色后可见,VCAM-1蛋白的阳性表达为主要分布于胞膜的棕黄色颗粒。Ox-LDL诱导组THP-1单核细胞的棕黄色颗粒较正常对照组明显增多。而以不同浓度的DHEA干预后胞膜着色较Ox-LDL诱导组明显减弱。五. VCAM-1mRNA表达的观察高脂组兔主动脉VCAM-1mRNA表达(0.9651±0.0992)明显高于正常对照组(0.2178±0.0495),DHEA干预组VCAM-1mRNA表达(0.6499±0.1434)较高脂组有所下降,而同时加入全反式维甲酸组VCAM-1mRNA表达与未加入全反式维甲酸组的DHEA干预组相比没有显著差异(P>0.05)。Ox-LDL诱导组THP-1细胞表达VCAM-1mRNA(0.6236±0.0237)较正常对照组(0.1693±0.0068)明显增加,但加入不同浓度的DHEA干预后其表达有所下降,在DHEA浓度为5μmol·L-1时THP-1细胞VCAM-1mRNA表达(0.2988±0.0312)下降较明显(p<0.05)。而同时加入全反式维甲酸组与5μmol·L-1 DHEA干预组相比差别没有显著性意义。结论一. DHEA可以抑制高脂喂饲兔主动脉粥样硬化斑块的形成.二. DHEA通过抑制高脂喂饲兔主动脉VCAM-1 mRNA和蛋白的表达,发挥抗动脉粥样硬化的作用.三. DHEA可以抑制OX-LDL诱导的THP-1细胞VCAM-1 mRNA和蛋白的表达.四.全反式维甲酸不能明显增强DHEA抑制VCAM-1表达的作用.