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血管新生参与了创面愈合,还与肿瘤、增生性瘢痕等疾病相关。新生血管的功能依赖于周细胞的包裹。目前已经明确循环纤维细胞（circulating Fibrocytes,CFs）可以分化为周细胞,但其向血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VECs）迁移的机理还不明确。本课题采用Real-time PCR、多克隆抗体孵育、过表达或干扰目的蛋白表达等方法,筛选出介导VECs招募CFs的关键趋化因子及其受体,初步探讨了VECs招募CFs的机制,有望进一步揭示血管新生的机理,并有可能为治疗慢性创面、肿瘤、风湿病等血管新生相关疾病提供新的药物作用靶点。本研究主要分为四个部分1.CFs与VECs共培养后上调的趋化因子及趋化因子受体的初步筛选目的:通过基因芯片技术筛选出CFs与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）共培养后上调的趋化因子及趋化因子受体。方法:分离/纯化人CFs,与第三代HUVECs在Transwell内共培养24小时,采用基因芯片技术,初步筛选出上调的趋化因子以及趋化因子受体。结果:在HUVECs内可以检测到23种趋化因子,其中6种趋化因子的mRNA水平在与CFs共培养后明显上调,如CCL2,CXCL2,CXCL8,CCL23,CCL15,CXCL16;而在CFs内可以检测到10种趋化因子受体,其中CCR1,CXCR2和CXCR4分别为以上6种相应趋化因子的受体,CCR6的表达水平很高,且在共培养后其表达水平更高。提示HUVECs趋化CFs可能与多种趋化因子和多种趋化因子受体相关。2.VECs趋化CFs的过程中关键趋化因子及关键趋化因子受体的筛选目的:探讨VECs趋化CFs的过程中起关键作用的趋化因子及趋化因子受体。方法:将CFs与HUVECs在Transwell体系内共培养48小时,通过Real-time PCR技术在基因水平进一步检测上述6种趋化因子以及4种趋化因子受体的表达;分别采用ELISA及Western-blot的方法在蛋白水平进一步检测这6种趋化因子以及4种趋化因子受体的表达。将CFs与HUVECs在Transwell体系内共培养,分别添加6种趋化因子以及4种趋化因子受体的多克隆抗体,24小时后,光镜下观察发生趋化的CFs的数目。结果:Real-time PCR结果显示,除CXCL16外,其余5种趋化因子以及4种趋化因子受体的表达在共培养后均明显上调;ELISA结果显示,除CXCL16、CCL23外,其余四种趋化因子的蛋白表达水平在共培养后明显上调;Western-blot结果显示,除CCR6外,其余3种趋化因子受体的蛋白表达水平在共培养后明显上调。多克隆抗体孵育实验显示:向共培养体系中分别添加上述趋化因子及趋化因子受体的多抗后,除CXCR4多抗外,均可不同程度的抑制HUVECs对CFs的趋化作用,其中CCL15多抗和CCR1多抗的抑制作用最强,而CCL15和CCR1是一对趋化因子及相应的趋化因子受体。以上结果表明VECs趋化CFs与多种趋化因子和多种趋化因子受体相关,其中CCL15/CCR1轴可能起关键作用。3.VECs趋化CFs的过程中关键趋化因子及关键趋化因子受体的验证目的:验证CCL15/CCR1是VECs趋化CFs的过程中起关键作用的一对趋化因子及其受体。方法:购买过表达CCL15的慢病毒、抑制CCL15表达的siRNA,及其相应的对照病毒及NC siRNA,并购买过表达CCR1的慢病毒及抑制CCR1表达的shRNA,以及其相应的对照病毒。将过表达CCL15的慢病毒或抑制CCL15表达的SiRNA感染/转染HUVECs,并将其接种至Transwell的下层培养室内,对照组感染/转染对照病毒/或者NC siRNA。通过荧光显微镜观察、Real-time PCR及ELISA确定已成功感染/转染并稳定表达后,将CFs接种至Transwell的上层小室内,共培养24h,将上层小室取出并用多聚甲醛固定,并使用结晶紫染色,光镜下观察CFs趋化到Transwell下层小室的数量。将过表达CCR1的慢病毒或抑制CCR1表达的ShRNA感染CFs,并将其接种至Transwell的上层小室内,对照组感染对照病毒或shRNA。通过荧光显微镜观察、Real-time PCR及Western-blot确定已成功感染并稳定表达后,将HUVECs接种至Transwell的下层培养室内,共培养24h,将上层小室取出并用多聚甲醛固定,并使用结晶紫染色,光镜下观察CFs趋化到Transwell下层小室的数量。结果:与阳性对照组（感染/转染对照病毒或NC siRNA）及阴性对照组（不感染/转染病毒或SiRNA）比较,过表达CCL15及CCR1的实验组CFs趋化的数目明显增多,抑制CCL15及CCR1表达的实验组CFs趋化的数目明显减少。说明CCL15/CCR1轴确为一对在VECs趋化CFs的过程中起关键作用的趋化因子及趋化因子受体。以上实验结果初步揭示了血管内皮细胞招募循环纤维细胞的机制。4.VECs对CFs的体外招募研究目的:证实在体外培养状态下,VECs可将CFs招募至其周围并建立稳定的细胞间连接。方法:将VECs和CFs共培养于胶原凝胶中,通过基因芯片分析、实时定量PCR分析、电镜、共聚焦显微镜、荧光显微镜等观察并分析VECs与CFs之间的空间关系和二者在空间中之中的相互作用。结果:VECs可将CFs招募至其周围,被招募来的CFs能够包绕VECs并与其建立稳定的单向间隙连接,形成微血管样结构。证实了在体外培养条件下,VECs通过相应的趋化因子及受体对CFs进行招募,并建立了功能性的毛细血管样结构。提示CFs和HUVECs可能成为构建组织工程化微血管的种子细胞。综上所述,在VECs趋化CFs的过程中,多个趋化因子及趋化因子受体均起一定作用,其中CCL15/CCR1轴为一对关键的趋化因子及趋化因子受体。此外,CFs向VECs迁移后,二者之间可形成具有单向间隙连接的微血管样结构。以上结论初步揭示了VECs招募CFs的机制,有望进一步揭示血管新生的机理,并有可能为治疗慢性创面、肿瘤、风湿病等血管新生相关疾病提供新的药物作用靶点,以及可能为组织工程微血管的研究提供更为可靠的种子细胞。