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目的:辽宁省为龙胆药材的道地产区,但由于植被的破坏及人类的过度采挖,野生龙胆资源日益减少。本实验以辽宁省不同产地野生与栽培龙胆药材为研究对象,采用TOE思路对野生及栽培龙胆八种化学成分的含量及生长指数进行全面比较,同时对龙胆进行叶绿体全基因组测定。从宏观到微观的角度对龙胆的药材质量进行较为全面的评价,同时可为栽培龙胆替代野生龙胆药材提供理论依据,为栽培龙胆药材提供科学指导。材料与方法:1材料:本课题实验材料采集于辽宁省9个不同野生或栽培产地及各产地不同基地的龙胆草共20批(辽宁省抚顺市清原县、抚顺市新宾县、本溪市桓仁县、丹东市宽甸县、大连市庄河市、鞍山市岫岩县、营口市盖州市、铁岭市、丹东市),药用部位为其根及根茎。经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为龙胆Gentiana scabra Bunge。2方法:2.1采用直尺、游标卡尺直接测量及色差仪测定法法进行生长指标及药材粉末色度的测定并对药材进行拍照保存,从外观性状的角度对辽宁省不同产地野生与栽培龙胆进行差异比较。2.2采用紫外分光光度法分别对龙胆药材中黄酮及多糖的含量进行测定,采用显著性差异检验法(LSD法)分析结果。2.3采用高效液相色谱法测定不同野生与栽培产地龙胆草药材中裂环环烯醚萜苷类,即龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷以及苦龙胆酯苷的含量,综合评价龙胆药材质量。2.4采用高效液相色谱法建立不同产地野生及栽培龙胆的指纹图谱。2.5采用高通量测序法测定龙胆的叶绿体全基因组。结果:1.外观性状对满足正态分布的平均根粗、平均须根数、L、a、b、E值进行独立样本t检验的结果如下:平均根粗P=0.427>0.05,野生品与栽培品的平均根粗的差异不具备统计学意义;平均须根数P=0.074>0.05,野生品与栽培品的平均须根数差异不具备统计学意义;L值P=0.011<0.05,故可认为野生品与栽培品的L值不等;a值P=0.62>0.05,野生品与栽培品的a值差异不具备统计学意义;b值P=0.06>0.05,野生品与栽培品的b值差异不具备统计学意义;E值P=0.01<0.05,可认为野生品与栽培龙胆的E值具显著性差异,具有统计学意义。2.化学成分2.1多糖:野生品与栽培品多糖含量正态性检验的统计量分别为0.914、0.870,P值分别为0.343、0.065,均>0.05,满足正态分布;四种Levene统计量分别为4.461、4.073、4.073、4.517,均>0.05,方差齐性。独立样本t检验P=0.318>0.05,野生品与栽培品的多糖含量差异无统计学意义。2.2五种环烯醚萜苷类:除了马钱苷酸与苦龙胆酯苷外,龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷在野生与栽培龙胆间均无显著性差异,其中马钱苷酸与龙胆药材的L值显著相关,马前苷酸含量越高,药材的明亮度越高。2.3黄酮:野生品与栽培品黄酮含量正态性检验的统计量分别为0.825、0.932,P值分别为0.282、0.087,均>0.05,满足正态分布;四种Levene统计量分别为3.285、3.453、4.073、3.986,均>0.05,方差齐性。独立样本t检验P=0.031<0.05,野生品与栽培品的黄酮含量差异具有统计学意义。2.4齐墩果酸:野生品与栽培品在齐墩果酸含量上由于部分未达到检测限,样本数量较小,进行数理分析无统计学意义,但通过含量测定的结果看,栽培品龙胆齐墩果酸未达到定量限的比例为15.38%,野生品未达到定量限的比例为66.67%,因此野生品的齐墩果酸含量显著小于栽培品的含量。3.叶绿体全基因组分析:龙胆叶绿体基因组CP序列全长149,192 bp,总GC含量为37.61%,其中SSC(17,269bp)和LSC(81,353 bp)分别由4个典型结构组成,组成一个单独的IR(25,285 bp)。龙胆CP基因组编码125个独特基因,其中蛋白质编码基因84个,t RNA基因38个,rRNA基因4个,IR区44个拷贝。结论:一、外观性状1.数值分析可发现:野生龙胆药材比栽培龙胆药材更白,横环纹所占比例更大,而其他指标上并无差异。2.用肉眼观察可发现:野生龙胆药材形态较为饱满,颜色偏黄白色,多数具有主根,干燥后须根较为分散;而栽培龙胆药材须根较为皱缩,颜色偏红棕色,不具主根,干燥后须根聚集为一团。3.龙胆药材的马钱苷酸含量与颜色具有相关性,提示马钱苷酸含量越高,龙胆药材颜色可能越白。二、化学成分1.指纹图谱相似度评价结果与HPLC指纹图谱分析表明野生龙胆、人工栽培龙胆及对照药材化学指纹图谱共有16个共有峰。经对照品指认,指认出共有峰5个,分别为:马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷和苦龙胆酯苷,经相似度计算大部分样品相似度>0.9,提示野生品与栽培品相似度较高。2.环烯醚萜苷类:野生品马钱苷酸含量显著性大于栽培品,而野生品苦龙胆酯苷含量小于栽培品。而龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷的含量无差异。3.多糖含量:野生品与栽培品多糖含量无差异。4.黄酮含量:野生品黄酮含量小于栽培品。5.三萜类:龙胆野生品的齐墩果酸含量显著小于栽培品的含量。三、叶绿体全基因组测序结果龙胆叶绿体基因组CP序列全长149,192 bp,总GC含量为37.61%,其中SSC(17,269bp)和LSC(81,353 bp)分别由4个典型结构组成,组成一个单独的IR(25,285 bp)。龙胆CP基因组编码125个独特基因,其中蛋白质编码基因84个,t RNA基因38个,rRNA基因4个,IR区44个拷贝。一个含有两个内含子的基因:TRNF-AAA,trn Y-ATA,trn DATC,PSBA,atp F,Trni-TAT,trn N-ATT,rpo C 1,rpl2,ycf 2,ycf 15,ndh B,NDHA,ycf 1,rps 12.