对因外伤和软骨病变所导致的关节软骨退变或功能丧失的治疗，目前临床上尚无有效的方法。近十年发展起来的组织工程科学给解决这一难题带来了希望，其中软骨组织工程是组织工程学科中发展最为迅速的领域，它的发展有望彻底解决这一医学难题。但是制约软骨组织工程发展的困难之一，即如何获得大量具有正常软骨细胞表型的种子细胞(软骨细胞)，到目前为止还没有得到有效的解决。随着克隆技术和转基因技术的发展，许多学者从不同方向对这一问题进行了大量的研究，并取得了一定的进展，其中干细胞(包括ES、MSCs)的体外定向诱导分化，体外延长正常组织细胞寿命被认为是解决这一难题的重要研究领域之一。 本研究通过真核表达载体和脂质体转染的方法，将端粒酶催化亚基hTERT转入羊髁突软骨细胞(mandibular condylar chondrocyte，MCCs)，筛选阳性克隆并进行一系列的生物学特性检测；以转染的软骨细胞为种子细胞，与支架材料β-TCP复合，体外构建工程化软骨，修复软骨缺损并对软骨修复情况进行检测和评价。研究结果如下： 经双酶切和电泳鉴定后，对质粒pCI-hTERT进行大量提取、纯化，采用脂质体转染的方法把hTERT导入羊的MCCs，经G418筛选，有限稀释法进行阳性克隆挑选并扩大培养。MCCs原代培养以多角形为主，在体外培养6-8代后，则大多数变为梭形或纺锤形，出现老化征象，分裂增殖速度降低并最终停止增殖。20株阳性转化软骨细胞传代均超过40代，其中13株传至150代以上仍显示旺盛的分裂增殖趋势，将其称为永生化髁突软骨细胞(immortalized mandibular condylar chondrocyte，IMCC)。IMCCs在培养过程中多数呈现多角形，体积小于MCCs。 MCCs和IMCCs的生长曲线显示，两者的PD分别为22.4h和65.2h。后者是前者的2.9倍。两者在无血清的情况下均不能生长，在低浓度血清中生长速度低于高浓度血清，但在相同的条件下永生化软骨细胞的增殖速度明显快于正常软骨细胞。 组织形态学检测发现，在p4 MCCs和p40、p80 IMCCs中60条染色体分别占92％、83％、75％。流式细胞仪检测显示，IMCCs的S期比例升高，说明IMCCs具有旺盛的分裂增殖能力。IMCCs的平板克隆和软琼脂克隆形成率分别为16％和6.2％，而MCCs则不能在软琼脂中生长；在观察期限内IMCCs在裸鼠体内无致瘤性。 IMCCs功能检测表明，IMCCs端粒酶活性呈阳性表达，而MCCs无端粒酶活性；Ⅱ型胶原原位杂交结果阳性，IMCCs具有软骨细胞的表型和合成Ⅱ型胶原的能力； 博士研究生论文IMCCs的碱性磷酸酶活性显著低于正常软骨细胞和成骨细胞，Von Kossa染色结果为阴性。 软骨缺损修复结果显示，以IMCCs为种子细胞的工程化软骨具有较好的软骨缺损修复能力，缺损区有大量的软骨样组织形成，与单纯材料组和空白对照组有显著差异。 本实验通过导入hTERT使软骨细胞获得永生化。以永生化软骨细胞为种子细胞，采用组织工程技术对关节软骨缺损进行修复，并初步取得成功。本研究不但为端粒酶在组织工程中应用的可行性进行了有益的探索，而且对解决软骨组织工程种子细胞来源的难题进行了重要的尝试，同时也为研究软骨细胞体外的生物学行为和端粒酶的作用机理提供了有用的细胞模型。