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直链麦芽低聚糖是由3-10个葡萄糖单元以α-1,4-糖苷键连接而成的一种功能性低聚糖,因其具有良好的理化性质和独特的生理功效,在食品、化工及医药领域中有着广泛的应用前景。直链麦芽低聚糖生成酶（Maltooligosaccharide-forming amylase,MFA酶,EC 3.2.1）是工业制备直链麦芽低聚糖的关键酶制剂,但大多数MFA酶的工业化应用受到产物特异性差或热稳定性差的限制。本研究室前期挖掘了一种来源于Pseudomonas saccharophila STB07的MFA酶(MFAps酶),其产物特异性高,主产物直链麦芽四糖的比例最高可达到76.25%,具有较高的工业应用潜力,但是该MFAps酶热稳定性较差,60℃下的半衰期(t1/2)只有10 min。然而到目前为止,关于MFA酶热稳定性改善的研究鲜有报道。因此,有必要研究MFAps酶的热稳定机理,以提升其热稳定性。本论文以MFAps酶为研究对象,通过对MFAps酶柔性区域的深入分析,设计了特征模块改造、二硫键引入、计算机辅助的高柔性loop改造这三种柔性区域分子改造方案,得到了热稳定性改善的MFAps酶突变体,并对相关机理进行了探究,可为其他MFA酶的分子设计和热稳定性改善奠定理论基础。主要研究内容和结果如下:首先,通过Alpha Fold2蛋白质建模软件构建了MFAps酶的结构模型,利用B-FITTER软件和分子动力学（MD）模拟分析了MFAps酶的静态灵活性和动态灵活性。研究发现loop5（P57-S91）、loop7（114-136）、loop8（C140-H167）、loop30（G419-G432）和碳水化合物结合模块20（CBM20）区域柔性高且对热敏感,将这些柔性区域作为后续分子改造的关键区域。其次,基于MFAps酶的模块化结构特征改造C端柔性区域以提高其热稳定性。通过定点突变构建了3个C端突变体:截短铰链区突变体（Δ423-425）、更换铰链区突变体（R-linker）、截断铰链区和CBM20突变体（ΔCBM）。测定突变体的酶学性质发现3个突变体的热稳定性均有不同程度的提高,突变体Δ423-425、R-linker和ΔCBM在60℃下的t1/2比野生型分别提高了34.5%、14.6%和22.4%。其中,突变体ΔCBM的催化活性也有明显提高,比酶活（899.20 U/mg）增加到野生型的2.10倍。MD模拟表明,删除C端柔性区域可以显著提高酶的整体稳定性。通过分析突变体的酶解产物后发现,突变体ΔCBM的主产物直链麦芽四糖的比例比野生型提高了15.9%,具有更高的工业应用潜力。然后,利用计算机辅助设计的方法在MFAps酶的柔性区域引入额外的二硫键以提高其热稳定性。先利用二硫键在线设计工具DSDBASE-MODIP和Disulfide by Design 2.0预测MFAps酶中可能引入二硫键的位点,在此基础上采用Fold X软件评估候选突变体的解折叠自由能变化（ΔΔG）,及视觉检测模拟结构,筛选得到2个MFAps酶的候选二硫键突变体A211C-S214C和S409C-Q412C。其中,突变位点离催化中心更近的突变体A211C-S214C热稳定性明显提高,60℃下的t1/2是野生型的2.64倍;而突变位点离非催化结构域CBM20更近的突变体S409C-Q412C的热稳定性则没有明显变化。MD模拟结果表明,二硫键A211C-S214C和S409C-Q412C均能提高MFAps酶的整体稳定性,但二硫键距离催化中心的远近与其对酶热稳定性的影响密切相关。引入二硫键增加活性中心的刚性,可以更显著地提高MFAps酶的热稳定性。最后,基于ΔΔG计算改造高柔性loop以提高MFAps酶热稳定性。运用Fold X算法对4个高柔性loop包含的100个氨基酸进行虚拟饱和突变,通过计算ΔΔG预测得到有望提高热稳定性的突变位点。综合ΔΔG的预测结果及氨基酸性质的变化,共筛选30个点突变进行构建。测定突变体性质,将催化活性明显改善的突变体V58P和热稳定性明显改善的突变体I157K组合得到了双突变体V58P+I157K。V58P+I157K的比酶活是野生型的1.65倍,且比V58P和I157K都更稳定,60°C保温下的t1/2达到了野生型的2.61倍。MD模拟结果表明,点突变不仅改变突变所在位置附近的动力学性质,同时还会影响与突变点距离较远的区域,突变引起的loop8和loop30的变化可能是酶热稳定性得以提高的主要原因。