棉铃虫细胞色素P450 CYP9A33与羧酸酯酶CXE6基因克隆与表达分析

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棉铃虫Helicoverpa armigera为世界性农业害虫,危害多种经济作物。由于化学农药的大量使用,其对多种农药产生了抗药性。作为典型的鳞翅目夜蛾科昆虫,其嗅觉灵敏,成虫通过触角检测环境中的气味物质,以寻找寄主、配偶与产卵场所。气味物质通过其触角表皮进入感器腔道淋巴液,由气味结合蛋白运至嗅觉受体,随后在感器腔内或感器基部细胞中被相关酶降解,以使昆虫免遭环境气味物质的持续刺激。因此其阐明嗅觉信号失活机理,有利于寻找新的防治靶标位点。本研究以棉铃虫头部转录组数据为基础,采用基因拼接、BLAST、RT-PCR、RACE等手段从棉铃虫触角中克隆得到一条P450基因、一条羧酸酯酶基因,并采用荧光定量PCR技术研究了二者的时空表达情况,对P450基因进行了原核表达与Western blot检测,主要结果如下:(1)所得棉铃虫P450基因cDNA序列全长1772bp,命名为CYP9A33(GenBank登录号为JX486677),其开放阅读框全长1590bp,编码529个氨基酸残基,预测蛋白质分子量和等电点分别为61.62kD和7.97。氨基酸序列比对结果表明,CYP9A33与其他昆虫CYP9A亚家族序列一致性达60%以上,其中与甘蓝夜蛾Mamestra brassicae CYP9A13一致性最高,达75%。二者二级结构高度一致,6个底物识别位点(substrate recognition sites,SRSs)序列一致性达61%,底物与酶结合通道开关I螺旋中SRS4序列完全相同;CYP9A33编码蛋白中第25-529位氨基酸位于膜表面,2-24位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋。(2)CYP9A33在成虫各组织中均有表达,以腹部和头中表达量最高,且雌、雄蛾各组织间表达量均差异显著。在棉铃虫各个发育阶段也均表达,以雄蛹中的表达量最高,其次为雌蛹;在卵及各龄期幼虫中表达量均较低,且差异不显著;除刚羽化雄蛾和羽化后24h雌、雄蛾触角外,CYP9A33在其它日龄成虫触角中的表达量均显著高于幼虫与卵。(3)成功构建了CYP9A33基因部分片段融合表达载体,导入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,经过IPTG诱导以及SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明融合蛋白得到了正确表达。(4)所得羧酸酯酶基因cDNA序列全长2002bp,命名为HaCXE6(Genbank登录号为JX306730)。其开放阅读框全长1623bp,编码540个氨基酸,预测其蛋白分子量为61.02kD,等电点为8.06;该基因预测氨基酸序列与海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis触角羧酸酯酶CXE6的一致性最高,为68%;含有丝氨酸活性中心FGGDPSKVTTAGESYG和催化三聚体(Ser199,Glu323,His434)等羧酸酯酶保守结构域。系统发育树进化分析表明,昆虫亲缘关系越近,羧酸酯酶氨基酸序列一致性越高,同属夜蛾科的棉铃虫、海灰翅夜蛾、西非蛀茎夜蛾Sesamia nonagrioodes聚在一起。棉铃虫不同功能COEs序列关联性分析显示,HaCXE6与棉铃虫其他功能羧酸酯酶一致性很低,却独与气味降解酶CCE006a最先聚在一起,预测HaCXE6可能参与嗅觉相关功能。(5)实时荧光定量PCR显示HaCXE6在棉铃虫成虫各组织中均有表达,以雌蛾腹部与雄蛾足中表达量最高,且雌、雄蛾各组织间表达量均差异显著,腹部、足、触角等组织差异极显著水平。HaCXE6在棉铃虫不同发育阶段均有表达,其中以雄蛹期表达量最高,其次为雌蛹期;成虫期仅触角中表达量就显著高于各幼虫期整个虫体的表达水平。
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