ACS患者外周血CD4+Foxp3+Helios+调节性T细胞下调及其机制研究

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第一部分ACS患者外周血CD4+Foxp3+Helios+Tregs减少及其意义目的:调节性T细胞在急性冠脉综合征中发挥着重要作用,但是关于究竟是哪种表型的调节性T细胞在起作用却众说纷纭。CD25和Foxp3一度被认为是经典的调节性T细胞标记物,但是随后的深入研究却发现,部分T细胞尽管表达CD25或是Foxp3,但却并不具备调节性T细胞的抑制功能,反而可以分泌效应性细胞因子,发挥效应性T细胞的作用。近期研究认为,转录因子Helios是具有抑制功能的Tregs的标记物,虽然在其他疾病中已有各种研究揭示其重要功能,但它在急性冠脉综合征中的表达情况却未见报道。因此,我们对急性冠脉综合征患者外周血调节性T细胞Helios的表达情况进行了研究。方法:本研究纳入73名急性冠脉综合征患者,30名稳定型心绞痛患者,48名对照人群,对其外周血Helios+调节性T细胞的分布情况进行了检测。应用流式细胞学方法检测外周血中CD4+CD25+,CD4+CD25+Foxp3+,和CD4+CD25+Foxp3+Helios+,以及CD4+Foxp3+和CD4+Foxp3+Helios+Tregs的比例及数量。用酶联免疫法检测血浆细胞因子白细胞介素-6(IL-6)及转化生长因子beta1-(TGF-beta1)的水平。应用实时定量PCR技术检测CD4+T细胞中Foxp3和Helios的表达情况。结果:相比于对照组和稳定型心绞痛组,急性冠脉综合征组患者外周血CD4+Foxp3+Helios+Tregs的比例和数量均显著减少;而CD4+CD25+,CD4+CD25+Foxp3+细胞在三组之间未见显著差异。CD4+Foxp3+Helios+Tregs的比例和数量与细胞因子IL-10,TGF-beta1表达水平存在正性相关关系。相比于对照组和稳定型心绞痛组,急性冠脉综合征组患者外周血CD4+T细胞中Foxp3以及Helios水平表达显著减少。结论:以上结果表明,CD4+Foxp3+Helios+Tregs可能在急性冠脉综合征中发挥作用。第二部分Helios基因敲减对调节性T细胞抑制功能的影响目的:本研究利用RNA干扰技术,进行Helios shRNA慢病毒转染,下调Tregs细胞中Helios的表达,观察Helios表达下调的Tregs抑制功能是否有所改变,从而探讨Helios在调节性T细胞功能中的潜在作用。方法:利用磁珠分选技术分选健康志愿者外周血的CD4+CD25+Tregs,应用Helios shRNA慢病毒对其进行体外转染,通过实时定量PCR和流式细胞学方法检测Helios shRNA慢病毒转染后Helios表达的下调程度。根据转染物的不同,将Tregs分为三组:(1)对照组(control group),未进行转染;(2)空载慢病毒转染组(con V group),所转染的病毒载体不含Helios shRNA序列;(3)Helios shRNA慢病毒转染组(Helios shRNA group),所转染的慢病毒含有效的Helios shRNA干扰序列。利用RT-PCR以及流式细胞学方法检测转染后各组Tregs细胞Helios的表达水平,ELISA检测相关细胞因子IL-10,TGF-beta1的表达水平。分选健康志愿者的外周血CD4+CD25-T细胞,对其进行CFSE-FITC染色,将上述三组不同的CD4+CD25+Tregs细胞分别与之进行不同比例的共培养。结合流式细胞学方法,检测共培养后CD4+CD25-(CFSE-FITC)效应性T细胞增殖情况;ELISA检测细胞体外共培养后上清液之中细胞因子IFN-gamma的表达变化,评价Helios shRNA慢病毒转染后的Tregs对CD4+CD25-T细胞的抑制作用的影响。结果:Helios shRNA慢病毒转染CD4+CD25+Tregs后,实时定量PCR和流式细胞检测显示,相比于对照组和空载慢病毒转染组,转染组Helios表达显著下调,抑制性细胞因子IL-10及TGF-beta1生成减少。相较于对照组和空载病毒对照组,Helios shRNA慢病毒转染组与CD4+CD25-T细胞共培养后,CD4+CD25-T细胞增殖受到的抑制作用减弱。结论:Helios下调导致调节性T细胞抑制功能受损。
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