表皮干细胞在创伤愈合过程中扮演着重要角色，目前利用表皮干细胞进行组织重建和转基因研究成为生物医学领域的重要方向。绿色荧光蛋白(GFP)是细胞生物学研究中应用最广泛的标记性蛋白质之一，不用加外源底物就能在活细胞中直接观察基因是否表达。本试验从山羊皮肤干细胞分离培养、生物学性特性鉴定、可塑性及GFP基因转染四个方面进行研究，为皮肤干细胞的临床应用提供基础资料。 1.山羊皮肤干细胞的分离培养 组织块培养法：浸洗、抗菌处理后，将皮肤切成0.1cm×0.1cm左右的小块，表皮面朝上贴于铺有0.1％明胶的培养皿中，加少量培养液浸润，2h后用HDMEM/F12(3∶1)+20％血清+5μg/mL胰岛素+0.5μg/mL氢化可的松+100单位双抗培养液培养，3日换液一次。有细胞脱出后把血清体积分数换为10％进行培养。 DispaseⅡ酶消化法：浸洗、抗菌处理后将皮肤块切割成0.5cm×1cm左右的条状，在含4mg/mLDispaseⅡ酶的小瓶中4℃冷消化16h。分离表皮与真皮，将表皮剪成糜状，0.25％胰酶37℃消化5-7min后中和，过滤，离心，接种。用HDMEM/F12(3∶1)+10％血清+5μg/mL胰岛素+0.5μg/mL氢化可的松+10ng/mLEGF+双抗100μg/mL培养液培养。 胰酶消化法：浸洗、抗菌处理后将皮肤块切割成0.5cm×1cm左右的条状，用0.25％胰酶40C冷消化12h。分离表皮与真皮。将表皮剪成糜状，过滤，接种。 组织块培养法简单易行，组织块可重复利用，但原代细胞脱出时间较长，平均8d，需15d以上才能传代，原代传代通常采用差别消化法。季节对细胞脱出时间、原代传代时间、传代数有显著影响。春夏季细胞迁出时间(4.9±1.4d)和原代细胞传代时间(10.3±2.5d)比秋冬季短(10±1.5d，20.3±1.7d)，传代数(7.4±3.5代)比秋冬季多(4.5±1.5代)；DispaseⅡ酶消化法周期短，8d左右即可传代，细胞平均传代次数为6.5代。不同季节所得细胞无显著差异。但处理麻烦。用本法最高传14代仍无明显分化。胰酶消化法分离细胞数量远活力很差，难以长期传代，平均仅传3.2代。与组织块培养法、DispaseⅡ酶消化法在传代数上均差异极显著(p＜0.01)。 2.山羊皮肤干细胞的生物学特性 显微镜下观察可见细胞胞体透亮、体积小、球形、致密，核质比高，数日后呈镶嵌多角形，铺路石样生长，存在典型克隆团，有时出现PGCs样集落。 分离培养的细胞体外增殖能力强，增殖能力下降。目前已传至第14代。细胞贴壁能力对黏附底物依赖性强，有无底物细胞贴壁率差异显著，细胞在不同底物上生长贴壁率差异不显著。培养至第10d时，第3代细胞克隆形成率在30％以上.以接种50个细胞的克隆形成率最高，为36％。细胞表达皮肤干细胞标志α6整合素，β1整合素，角蛋白K19，P63转录因子，CD71转铁蛋白受体，证实分离的细胞为皮肤干细胞。同时表达胚胎干细胞标志OCT-4转录因子。成功地进行液氮冷冻保存并复苏，第3代细胞解冻后细胞活力在80％以上。 3.皮肤干细胞体外诱导分化 1.用1μmol/L、5μmol/L5-氮胞苷处理表皮干细胞24h后继续用B液培养，10d后部分细胞可分化为心肌样细胞，α-actin抗体染色检测阳性。 2.表皮干细胞用1mmolβ-Me预诱导24h和5mmolβ-Me正式诱导4h后，分化出神经细胞，表达NSE,NF-200等神经细胞标志。 3.表皮干细胞在Vc、β-磷酸甘油和地塞米松诱导24小时后，出现大量针尖大小的圆形细胞。18d后AKP染色阳性，茜素红染色阳性。 4.皮肤干细胞的GFP基因转染 1.100mg/LG418培养KSC，10d时细胞绝大部分死亡，筛选时增加一个浓度梯度用G418150mg/L浓度进行筛选。 2.转染24h后荧光显微镜下显示绿色荧光强阳性，72h时荧光强度最大。 3.DNA浓度为1.6μg/mL，LipofectamineTM2000为4μL时，转染效率最高，达30％。 4.MTT测定结果表明转染能使细胞形态发生改变，活性显著下降，说明转染试剂对细胞具有一定的毒性。 5.转染细胞荧光持续5w，传5代，表明脂质体转染法可用于体外分化试验的跟踪观察但难以实现GFP基因的稳定转染，不适于作为细胞移植实验效果的长期跟踪观察。