金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是引起食源性疾病的主要致病菌之一。食用受其污染的食物会导致食物中毒,出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状,严重时甚至危及生命。快速、准确地检测食品中的金黄色葡萄球菌,对保障公众健康和食品安全具有重要意义。电化学生物传感器具有灵敏度高、响应速度快、成本低等优点,利用其检测食源性致病菌已成为目前的研究热点。CRISPR/Cas系统是近年来快速发展的一项基因编辑技术,随着研究的不断深入,其强特异性和高灵敏度的优势,逐渐应用于核酸检测领域。特别是Cas12a系统独特的非特异切割活性可用于进一步提高生物传感器检测的灵敏度和准确性。跨越式滚环等温扩增（Saltatory rolling circle amplification,SRCA）是一种新型等温扩增技术,可实现对靶标的放大。与其他等温扩增技术相比,其具有简便、成本低、扩增效率高等优势。因此,本研究拟将SRCA技术、CRISPR/Cas12a系统与电化学生物传感器结合,开发一种灵敏度高、特异性强的新型生物传感器用来检测食品中的金黄色葡萄球菌。具体研究内容如下:（1）根据金黄色葡萄球菌nuc基因,选择含有原间隔基序（Protospacer-adjacent motif,PAM）的目的序列,设计筛选特异性引物,通过SRCA技术实现对靶标的高效扩增。（2）根据SRCA目的序列设计Cas12a系统的向导核糖核酸（CRISPR RNA,crRNA）,激活Cas12a蛋白的反式切割活性,建立CRISPR/Cas12a体系。（3）合成5’端修饰疏基,3’端修饰亚甲基蓝（Methylene blue,MB）的单链DNA（SH-ssDNA-MB）,作为电化学传感器的报告探针。并在玻碳电极表面修饰金纳米颗粒（AuNPs）,通过Au-S键将巯基修饰的报告探针（SH-ssDNA-MB）固定在电极上,构建电化学传感器。在此基础上,构建基于SRCA-CRISPR/Cas12a的电化学传感器,并对金黄色葡萄球菌进行检测。通过计算Cas12a裂解前后电化学保留信号比值ΔI%=（I0-I）/I0（I0:反应前电极上SH-ssDNA-MB的电流值;I:反应后电极上SH-ssDNA-MB的电流值）,验证该方法的可行性。对试验的关键因素进行优化,最终确定SRCA反应中Mg2+初始添加浓度为20 mM（添加量为6 μL）、Bst DNA聚合酶添加量为3.0 μL（终活力24 U）、反应温度为62℃、反应时间为50 min;SH-ssDNA-MB在电极上孵育时间为5h;Cas12a与crRNA浓度为1:2、Cas12a切割时间为50 min。在最优条件下,从线性检测范围、检出限、特异性、重复性和稳定性5个方面对该传感器进行性能评价,并通过人工加标试验和实际样品检测,对其可靠性、实用性进行评价。结果如下:该传感器对金黄色葡萄球菌基因组DNA的线性检测范围为4.15 fg/μL～4.15 ng/μL,线性方程Y=6.4725X+51.3432（R2=0.9983）,检出限为2.51 fg/μL;对金黄色葡萄球菌纯菌液的线性检测范围为3.9× 101～3.9× 107 CFU/mL,线性方程为Y=5.4774X+6.4957（R2=0.9822）,检出限为3 CFU/mL。在特异性试验中,金黄色葡萄球菌获得较高的ΔI%,非目标菌没有明显的电流变化,说明该方法具有良好的特异性。在重复性试验中,8个样本均表现出较为稳定的电流响应,相对标准偏差（RSD）为3.48%;在稳定性试验中,将制备的工作电极在4℃放置14天,测量其电流响应信号仍保持初始值的84.8%,表现出较好的稳定性。此外,在人工加标试验中计算该方法的回收率为98.8%～117.1%;对50份实际样品进行检测,以国标（GB4789.10-2016）作为对照,计算得出该方法的敏感性、特异性、符合率分别为100%、97.8%、98%。综上所述,基于SRCA-CRISPR/Cas12a技术建立的电化学生物传感器具有特异性强、灵敏度高的特点,为食源性致病菌的检测提供了新的研究思路。