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目的通过线拴法制备SD雄性大鼠中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的脑缺血再灌注模型,体外培养缺氧缺糖及复氧(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)BV-2细胞/原代星形胶质细胞模型,观察叶酸缺乏(folic acid deficiency,FD)对大鼠脑缺血再灌注模型和体外氧糖剥夺/复氧细胞模型中小胶质细胞/星形胶质细胞活化及其炎症因子表达的影响,通过相关抑制剂及叶酸缺乏共同干预探讨脑缺血再灌注后小胶质细胞及星形胶质细胞活化的机制,为防治与叶酸缺乏相关的脑缺血性疾病提供新的治疗方法及实验依据。方法第一部分:30只体重在120-150 g的雄性SD大鼠随机分为假手术组(SHAM)、大脑中动脉缺血再灌注组(MCAO)、叶酸缺乏+大脑中动脉缺血再灌注组(MCAO+FD),每组10只。正常饲料/叶酸缺乏饲料喂养28天后进行MCAO手术;造模后脑组织制成石蜡切片,苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin,HE,n=4)和Fluoro-jade B法(FJ-B,n=4)检测大鼠大脑海马亚区神经细胞的改变,免疫荧光法检测脑组织Iba-1、TNF-α、IL-1β、IL-6和Notch1表达情况(n=4)。Western blot检测海马亚区中的Iba-1、Notch1和NF-κB p65的蛋白表达情况(n=4)。体外培养BV-2细胞,叶酸缺乏/正常培养基培养细胞7 d,用DAPT干预后,建立缺氧缺糖模型,提取各组细胞蛋白后Western blot检测TNF-α、IL-1β、IL-6、Notch1和NF-κB p65的蛋白表达情况(n=4)。第二部分:90只体重在120-150 g的雄性SD大鼠随机分为假手术组(SHAM)、大脑中动脉缺血再灌注3 h组(MCAO 3 h)、MCAO 6 h组、MCAO 12 h组、MCAO18 h组、MCAO 24 h组、MCAO 72 h组、叶酸缺乏+大脑中动脉缺血再灌注12 h组(FD+MCAO 12 h)及FD+MCAO 24 h组,每组10只。正常饲料/叶酸缺乏饲料喂养28天后进行MCAO手术;造模后脑组织制成石蜡切片,免疫荧光法检测脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6、GFAP、pSTAT3和caspase3表达情况(n=4)。体外培养原代星形胶质细胞,叶酸缺乏/正常培养基培养细胞7 d,分别用IL-6抑制剂(LMT-28)、STAT3通路抑制剂(C188-9)、JAK-2通路抑制剂(AG490)和JAK-1通路抑制剂(Filgotinib)干预后,建立缺氧缺糖模型,MTS检测细胞活力,提取各组细胞蛋白之后Western blot检测TNF-α、IL-1β、IL-6、GFAP、caspase3、pSTAT3、pJAK-1的蛋白表达情况(n=4)。结果第一部分:与MCAO组相比,叶酸缺乏干预组:HE染色和FJ-B染色结果显示大鼠患侧海马CA1、CA3和DG区的神经细胞损伤加重,并且CA1区的神经损伤程度显著高于CA3和DG区(P<0.05);Western blot检测结果显示脑缺血再灌注海马区Iba-1、Notch1和NF-κB p65蛋白表达显著增加,免疫荧光检测结果显示大鼠患侧海马CA1、CA3和DG区小胶质细胞显著激活且TNF-α、IL-1β、IL-6和Notch1蛋白表达显著增加(P<0.05),并且CA1区的小胶质细胞炎症因子表达显著高于CA3和DG区,差异有统计学意义(P<0.05)。体外Western blot实验结果显示:叶酸缺乏培养使OGD/R后的BV-2细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、Notch1和NF-κB p65蛋白表达显著增加,DAPT干预后Notch1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达增加被显著抑制,以上各个指标的两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。第二部分:与SHAM组比较,MCAO 12 h组的大鼠患侧皮质区星形胶质细胞IL-6的表达显著增加,TNF-α和IL-1β的表达无显著变化,MCAO 12 h组和MCAO 24 h组患侧皮质区的星形胶质细胞显著被激活(P<0.05)。与MCAO组比较,叶酸缺乏干预之后GFAP表达无显著变化(P>0.05),IL-6、pSTAT3和caspase3的表达显著增加(P<0.05)。MTS检测原代星形胶质细胞活力结果显示OGD/R后细胞活力开始下降,复氧2 h后细胞活力下降到最低,差异有统计学意义(P<0.05),复氧24 h后细胞活力与对照组细胞无显著差异(P>0.05);Western blot实验结果显示原代星形胶质细胞的IL-6和pSTAT3蛋白表达在OGD/R 3 h后达到高峰,但IL-6表达增加的时间要早于pSTAT3;叶酸缺乏干预细胞后IL-6、pSTAT3和caspase3的蛋白表达进一步增加;与FD+OGD/R组比较,FD+OGD/R+Filgotinib组IL-6和pSTAT3的蛋白被显著抑制(P<0.05),而FD+OGD/R+AG490组IL-6和pSTAT3的蛋白无明显变化(P>0.05);FD+OGD/R+LMT-28组IL-6和pSTAT3的蛋白被显著抑制,FD+OGD/R+C188-9组IL-6和pSTAT3的蛋白也被显著抑制,以上各个指标两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立大鼠脑缺血再灌注模型,叶酸缺乏会加重大脑梗死后海马区神经细胞的病理损伤,同时也会使小胶质细胞激活并加重小胶质细胞的炎症反应,尤其对于CA1区影响更加严重,同时患侧海马Notch1和NF-κB p65的表达增加,体外叶酸缺乏干预BV-2细胞模型中TNF-α、IL-1β、IL-6、Notch1和NF-κB p65的表达也显著上调。阻断Notch1后TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κB p65的表达被显著下调,推测Notch1/NF-κB p65途径介导小胶质细胞免疫应答,这可能是叶酸缺乏加重脑梗死后神经系统损伤的分子机制之一。脑缺血再灌注大鼠患侧皮质区星形胶质细胞被显著激活,并诱导其IL-6的表达显著增加。叶酸缺乏干预后星形胶质细胞的IL-6和pSTAT3蛋白表达进一步增加,诱导星形胶质细胞caspase3蛋白表达增加。此外,在体外原代星形胶质细胞OGD/R模型中叶酸缺乏干预导致IL-6表达的增加能促进其STAT3磷酸化,反过来,pSTAT3的表达又会进一步加剧IL-6的生成,即星形胶质细胞IL-6的表达与pSTAT3之间可能存在交互作用。