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牙齿是人体的重要器官。牙齿的正常发育也是颌面部正常发育的必要条件。牙齿发育缺陷以及龋病、牙周疾病、外伤、肿瘤等所造成的牙齿缺损、缺失对人体身体和心理健康都有严重的影响。牙齿缺失后无法在体内自行修复再生,临床多采用种植、义齿修复等手段恢复缺失牙形态与功能。随着再生医学的发展,牙齿组织工程再生研究虽取得了极大的进展,但仍存在如何最大程度地诱导出种子细胞的成牙潜能、如何通过基因操控加速发育过程等问题需要解决。牙齿的发育由上皮与间充质的相互作用完成,Hedgehog信号通路是介导这一过程的其中一条信号通路。以小鼠为模式动物的研究集中在Hedgehog信号通路在牙齿发育中的作用,发现该通路不仅参与调控牙齿早期发生,且在后期形态发生过程也有重要作用,但关于Hedgehog信号通路在牙齿再生中的作用没有报道。哺乳类模式动物的局限性阻碍了对牙齿发育调控机制的深入研究。斑马鱼具有与哺乳动物牙齿结构和发育均有极大相似性的咽齿,同时具有活体成像追踪和原位研究的优势。本课题组前期建立了转基因鱼Tg(dlx2b:Dendra2-NTR),利用Mtz/NTR系统构建了咽齿体内损伤再生模型。本课题在此基础上,进一步确定损伤再生的咽齿牙位,并利用Hedgehog信号通路抑制剂对咽齿发育和再生过程进行处理,初步探索该信号通路在斑马鱼咽齿发育和再生过程中的作用,以期为完善牙齿发育调控机制和组织工程牙再生提供实验依据和支持。目的:探索Hedgehog信号通路在斑马鱼咽齿发育和再生中的作用。方法:50μM Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺(cyclopamine,Cya)处理不同时期的斑马鱼,通过原位杂交、茜素红染色、双光子共聚焦显微镜观察等方式,观察Hedgehog信号通路抑制后信号通路相关基因及咽齿发育相关基因的表达变化以及咽齿的发育变化。用12 mM Mtz处理转基因鱼Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)3-5 dpf(受精后天数,days post fetilization)后,获得咽齿体内损伤模型,撤去Mtz后,研究咽齿再生过程,利用原位杂交、茜素红染色、双光子共聚焦显微镜、抗体染色等相关实验方法,充分明确了损伤及再生的牙位,并在再生过程中使用50μM Cya处理,随后运用茜素红染色、双光子共聚焦显微镜等观察斑马鱼咽齿再生变化情况。结果:(1)利用50μM Cya处理斑马鱼胚胎30-56 hpf(受精后小时数,housr post fetilization),原位杂交结果显示Hedgehog信号通路配体基因shha(sonic hedgehog signaling molecule a)在咽部表达范围缩小,受体基因smo(smoothened)表达略有减弱,受体ptch1(patched 1)、ptch2(patched 2)表达完全消失,即咽部Hedgehog信号通路受到抑制。(2)50μM Cya处理斑马鱼胚胎30-56 hpf后,牙上皮标记基因fgf3(fibroblast growth factor 3)表达消失,咽齿特异性基因scpp5(secretory calcium-binding phosphoprotein 5)和fth1b(ferrintin,heavy polypeptide 1b)表达消失,显示咽齿早期发育受到抑制。咽齿发生的标记基因pitx2(paired-like homeodomain 2)表达消失,提示在处理时间点即30 hpf以前的牙齿发生过程中需要Hedgehog信号通路的参与。(3)在36-100 hpf用50μM Cya处理胚胎后,不能检测到矿化咽齿的发生;48-100 hpf处理后,咽齿形态较对照组小且不规则,鳃弓矿化受抑制,双光子下可见4V~1咽齿较对照组小,且基底部不规则,3V~1和5V~1发育较正常滞后;60-100 hpf处理后,咽齿基底部矿化未完全,双光子下可见4V~1牙齿仍较对照组小,3V~1发育接近正常,但5V~1发育滞后;72-100 hpf处理后,咽齿矿化发育接近正常,双光子下三颗咽齿发育均接近正常。(4)转基因鱼Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)咽齿损伤再生过程中,原位杂交显示基因scpp5在药物处理后表达消失,咽齿再生过程中表达恢复,茜素红染色也可观察到腹侧列位置3和5的咽齿损伤后完成再生,双光子共聚焦显微镜在细胞级别观察到了腹侧列位置3和5的咽齿硬组织结构的损伤与再生,抗体染色可见信号在咽齿腹侧列位置3和5的消失与再表达。(5)在咽齿再生过程使用50μM Cya处理后,茜素红染色及双光子共聚焦显微镜下均未见腹侧列位置3和5的咽齿再生。结论:Hedgehog信号通路参与斑马鱼早期30 hpf前的牙齿发生和早期发育以及形态形成;基于转基因鱼Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)和Mtz/NTR系统构建的斑马鱼咽齿损伤再生模型中,确定损伤后可再生的牙位是腹侧列咽齿3和5,在其再生过程中Hedgehog信号起着不可或缺的作用。