磺胺类药物ELISA快速检测方法的建立

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磺胺类药物作为人工合成抗菌药,已被广泛的应用于畜牧业生产过程中,其在畜产品中大量的残留,及由此对人体健康造成的危害已受到社会的普遍关注。本研究鉴于此,针对动物源性食品中磺胺类药物残留建立ELISA检测方法。 本文人工合成具有磺胺类药物对氨基苯磺酰胺公共母环的半抗原TS。采用混合酸酐法、碳二亚胺法合成人工免疫原、包被原,通过紫外扫描法对其偶联结果进行初步鉴定,结合免疫小鼠及新西兰白兔的试验,间接竞争ELISA监测表明多抗血清针对磺胺类药物产生特异性抗体,确证偶联成功。 经过筛选采用TS-BSA免疫原免疫新西兰白兔,用ELISA方法检测效价、特异性变化。其中4只新西兰白兔针对磺胺类药物产生的特异性抗体效价达到1:320,000,具有良好的特异性,最终选择效价高、特异性好的4号兔建立ELISA检测方法。确定TS-OVA对兔多抗血清的最佳包被浓度为0.156μg/mL。对兔多抗血清进行纯化,纯化蛋白浓度为18.5mg/mL,纯化后兔多抗血清对罗红霉素、环丙沙星、诺氟沙星、泰乐菌素、氟苯尼考、卡那霉素等6种药物的交叉反应率低于0.0215%,无交叉反应;对TMP的交叉反应率为10%。对SM<,2>、SMM、SMD、SMZ、SDM、SDM、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪等9种磺胺类药物绘制标准曲线,其中SMM、SMD、SMZ、SDM、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪的最低检测限低于磺胺类药物MRLs 0.1mg/kg,SM<,2>、SDM为1μg/mL高于磺胺类药物的MRLs. 用TS-BSA免疫原免疫BALB/c小鼠,经过间接竞争ELISA,选择效价高、特异性好的小鼠进行四次有效细胞融合,筛选到3株能稳定分泌抗磺胺类药物抗体的杂交瘤细胞株,分别为2F4、4A3、1G11,对2F4和4A3杂交瘤细胞株进行染色体分析,染色体数目在90~100。纯化后单克隆抗体对甲醇、乙腈、丙酮及乙酸乙酯等4种有机溶剂具有很好的耐受性。CiELISA试验表明本实验制备的单克隆抗体是针对磺胺类药物产生的,具有很好的簇特异性。纯化腹水对SDM、SM<,2>、SMD、SDM、SMM、SQ、SD、SMZ、磺胺氯哒嗪及磺胺氯吡嗪等10种磺胺类药物的最低检测限分别为150ng/mL、50 ng/mL、0.1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、0.03 ng/mL、0.12 ng/mL、0.0025 ng/mL和10 ng/mL。对罗红霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氟苯尼考及泰乐菌素等5种常用抗菌药的交叉反应率低于0.00125%,特异性良好,无交叉反应。
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