烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）是一种单链RNA病毒,是最早发现的病毒,也是目前研究得最为深入的模式病毒之一。TMV侵染宿主广泛,能侵染30多个科包括300多种植物,严重影响作物的产量和质量,目前针对TMV尚未有十分有效的防控措施。把抗病毒生物活性蛋白基因转入植物进行抗病毒育种是防治方法之一,可以避免使用病毒来源的基因可能带来的重组风险。FTX（Flammutoxin）是一种来自于金针菇的毒蛋白,能体外钝化TMV且在转基因普通烟中能延缓和减轻症状。实验室前期利用转基因技术将FTX271基因导入本氏烟中,并结合蛋白质组学技术,推测FTX271能激活本氏烟中的诱导抗病性,但具体途径目前尚未明确。本实验通过转录组测序,qRT-PCR技术以及酶活测定对转基因烟草的抗病性机制作进一步确认。（1）利用RT-PCR技术检验了 T2代转基因烟草植株的FTX271基因阳性率,结果显示50株烟草中19株为转基因阳性,阳性率为38%。说明FTX271在T2代出现了性状分离。利用Western blot对RT-PCR阳性烟草在蛋白水平上进行了验证,实验证明FTX271基因能在本氏烟体内稳定表达出FTX（251个氨基酸）的前体物质TDP（271个氨基酸）,TDPC-端氨基酸序列比FTX多20个。（2）通过结合转录组学和蛋白组学分析了转FTX271基因对T2代本氏烟的影响。对野生型烟草（WT）和转基因烟草（N）的转录组数据进行分析。以Qvalue≤0.01,log2FC≥1为阈值筛选差异表达基因,筛选到了 953个差异表达基因,其中580个上调,373个下调。对差异基因进行分析,发现转基因烟草中与植物抗病性相关的基因:LRR受体基因,NLR基因,抗病蛋白基因,热休克蛋白基因,Toll-作用蛋白基因,Ras相关蛋白等基因在转录组和蛋白质组分析中表达均上调;同时定位到植物-病原互作、半萜类和三萜类的生物合成、植物MAPK信号通路等与抗病性相关的生物通路上调。说明转FTX271能提高植物的防御反应。GO功能富集发现,除了防御反应,还富集到多条与细胞壁形成有关的代谢如葡聚糖代谢、纤维素代谢、细胞壁高分子代谢,提示转FTX271基因可能对植物的细胞壁产生影响。这与蛋白组学结果基本一致。（3）对转基因本氏烟（N）和感染了 TMV的转基因本氏烟（N-TMV）的转录组数据进行分析。以Qvalue ≤0.01,log2FC≥2为阈值筛选差异基因。共筛选到5394个差异表达基因,其中2997个表达上调,2397个表达下调。对上调基因进行KEGG富集分析,发现植物激素信号传导、植物MAPK信号通路、植物病原互作生物通路上调。表明感染TMV能进一步刺激转基因烟草的防御反应。对分别感染了 TMV的转基因烟草（WT-TMV）和野生型烟草（N-TMV）的转录组数据进行分析。以Qvalue≤0.01,log2FC≥2为阈值筛选WT-TMVvs-N-TMV组的差异基因。共筛选到1441个差异表达基因,其中725个基因表达上调,716个基因表达下调。对上下调的差异基因进行KEGG富集,发现上调基因富集到光合作用天线蛋白、甾体生物合成、萜类骨架生物合成等生物通路。下调基因富集到的有植物-病原互作、抗坏血酸和醛酸代谢、半乳糖代谢等生物通路。植物病原互作通路下调,表明与野生型烟草相比,转基因烟草感染TMV后引起的防御反应比较温和;转基因烟草的光合作用相关通路上调,提示转FTX271可能通过调节植物激素促进光合作用或者抑制TMV的积累从而减轻TMV对叶绿体的破坏,从而起到延缓并且减轻TMV在本氏烟中的症状。（4）使用瞬时表达和qRT-PCR两个方法分析了转基因烟草和野生型烟草在被TMV侵染后病毒的复制情况。瞬时表达的荧光观察结果表明转基因烟草能延缓TMV的表达及扩散,减轻TMV感染后的症状。qRT-PCR对TMV在烟草体内的表达情况进行了定量研究,结果表明野生型烟草中TMV在第三天开始表达,此后表达量不断上升,第7-9天TMV的增殖速度最快;在转基因烟草中,TMV在第5天开始表达,之后表达量也在升高,但表达量始终低于野生型烟草。采用qRT-PCR分别检测了野生型烟草、转基因烟草、接种TMV后第5天的一系列防御基因的表达情况。防御基因包括:抗病信号传导基因Rar1,水杨酸介导的系统抗性通路基因NPR1,细胞程序性死亡标记基因HIN1、HSR203J,抗病蛋白基因PR1、PR2、PR4、PR5,茉莉酸信号通路的关键基因COI1,脂肪酸氧化酶基因LOX2,乙烯通路关键基因CTR1、ETR1以及调控不同网络通路的通调基因NDR1。健康转基因烟草与野生型烟草相比,Rar1、PR1、PR2、PR4、PR5、COI1、LOX2表达上调。NPR1表达下调。FTX271基因可能通过茉莉酸途径增强本氏烟的抗病性,而茉莉酸通路和水杨酸通路存在拮抗作用,这可能是NPR1下调的原因。转基因烟草感染TMV后与健康转基因烟草相比,Rar1、HIN1、HSR203J、PR1、PR4表达上调,表明此时转基因烟草体内激活了 HR,引起了局部抗性,限制了病毒的快速传播。PPR5、COI1、LCOX2、CTR1、ETR1表达下调,表明系统抗性不明显。而感染TMV后转基因烟草体内产生的应激反应小于感染TMV的野生型烟草,表明转FTX271可能有利于维持烟草体内环境的稳定,有利于感染病毒的植株的生长。分别测定了野生型和转基因烟草体内感染TMV后第1、3、5、7、9天的四种防御酶活性。四种防御酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）以及几丁质酶（Chitinase）。结果表明健康转基因烟草体内的四种防御酶均高于野生型烟草,感染TMV后转基因烟草体内POD活性显著高于野生型烟草,而其他三种酶活性变化则不显著。POD是一种重要的氧化还原酶,能减缓植物HR反应过程中产生的ROS所造成的损失,可能提示转基因烟草体内处于防御反应的早期。结合上述实验结果,转基因烟草体内表达的TDP作为激发子与LRR受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MRPS5互作,激活了茉莉酸途径介导的诱导抗性,通过信号级联放大,使得防御酶活性增强,病程相关蛋白表达,同时激活了半萜和三萜类生物合成等途径合成小分子物质,使转FTX271基因烟草在病毒侵染前即获得抗性。TMV侵染植株后,引起转基因烟草和野生型烟草的基础免疫反应,烟草使烟草体内的ROS升高,并激活转基因烟草体内的HR。转基因烟草体内的HR和ROS可能会引起后续的系统抗性反应,并由茉莉酸介导下游一系列抗性基因的表达,从而抑制病毒在烟草体内的复制和传播。同时转基因烟草还通过光修复减轻TMV的症状。