目前研究发现,棕色脂肪组织(BAT)促进能量消耗,改善机体代谢,现已成为治疗代谢疾病的新靶点。棕色脂肪组织体积虽小,但产热能力很强,主要依赖于组织中的特异性蛋白--解偶联蛋白1(UCP1),发生质子渗漏产热不产能,这种产热方式是哺乳动物的主要产热方式。BAT会受神经中枢下丘脑的调节,主要通过调节下丘脑腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性,从而调节下丘脑中相应的核团或神经肽的表达,达到对神经中枢的控制,故下丘脑中AMPK在能量代谢调节中起着重要的作用。附子作为“温阳要药”,能够峻补诸脏之阳气,中医认为阳气是一身之气中具有温热、兴奋特性的部分,故从能量代谢角度可阐释为附子能促进生物体的能量代谢,增加机体产热。有大量研究表明,温热药能够作用于棕色脂肪组织,促进相关产热蛋白的表达,增强能量代谢,改善阳虚症状。经过前期查阅文献发现,目前的研究报道没有从棕色脂肪组织功能的方面去探究附子热性机制。阴附片和阳附片作为建昌帮两种独特的炮制品,目前的研究寥寥无几。当身体出现能量调节异常时,下丘脑中AMPK活性会被调节,BAT收到中枢传来的信号后开始工作,一方面调节胞内的特异性蛋白--UCP1的产热,另一方面控制脂质代谢,维持机体的能量平衡。故本研究从下丘脑AMPK蛋白--棕色脂肪组织--脂质代谢相关信号通路三个方面观察阴附片和阳附片对大黄所致阳虚小鼠的影响,其中主要从阴附片和阳附片影响棕色脂肪组织功能的角度出发,一方面探索阴附片和阳附片调控棕色脂肪组织的分子机理,以及影响机体代谢产热的作用机制。另一方面,与生附片做对比,探讨附子炮制成阴附片和阳附片后热性是否发生变化,并观察对比热性变化是否与阴附片和阳附片男女异用的作用差异相一致。主要从以上两个方面完善建昌帮阴阳附片的研究,以期能对附子传统加工技艺进行传承和保护,为阴附片和阳附片的应用提供更完整的理论基础。其主要研究结果如下:1阴附片和阳附片调节下丘脑AMPK表达的研究通过给予小鼠大黄混悬液造阳虚模型,造模成功后给予药液2周,分析阴附片和阳附片对小鼠下丘脑AMPK的表达及相应基因的表达。结果显示,对下丘脑AMPK蛋白的影响:与同性别正常组相比,雌性模型组AMPK蛋白的表达有明显上升,给予阳附片后,此蛋白水平受到抑制有将要恢复到正常状态的趋势;雄性各组AMPK蛋白的表达没有太大差异。对下丘脑AMPK基因的影响:同性别之间比较,模型组与正常组的AMPK基因表达水平相比具有统计学意义(P<0.01)。在雌性小鼠中,生附片组和阳附片组较模型组的AMPK基因表达水平显著降低(P<0.01);雄性小鼠的给药组较同性别模型组均有显著差异(P<0.01),其中阳附片抑制效果最好,其次为生附片组。对小鼠下丘脑中p-AMPK蛋白的影响:雌性小鼠中,模型组p-AMPK蛋白表达是最高的,与正常组,阳附片组有明显差异(P<0.05);对于雄性小鼠,p-AMPK蛋白的表达结果与雌性小鼠效果相同,阳附片抑制效果最好(P<0.01),其次为生附片组。2阴附片和阳附片调控棕色脂肪组织功能的研究通过观察棕色脂肪组织(BAT),细胞,蛋白及相应基因在大黄所致阳虚模型小鼠中的表达,探讨阴附片和阳附片是如何调控棕色脂肪组织功能的。给予小鼠大黄混悬液造阳虚模型,造模成功后给予药液2周后,采集棕色脂肪组织,进行苏木素-伊红(HE)染色观察BAT细胞变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测解偶联蛋白1(UCP1)及其m RNA的表达。结果显示,BAT的比重:与同性别正常组相比,模型组BAT的比重显著降低;雌性小鼠中生附片和阴附片较模型组相比BAT的比重显著增加,而雄性小鼠各给药组与模型组相比则无显著性差异;BAT组织中的细胞数量:与同性别正常组相比,模型雌性、雄性组细胞数量显著下降;在雌性小鼠中,阳附片组与模型组相比细胞数量显著上升;对于雄性小鼠,生附片组、阴附片组和阳附片组与模型组比较,细胞数量均显著升高,其中生附片组的效果最好;对于BAT中特异性蛋白UCP1的表达:同性别之间比较,模型组与正常组的UCP1表达水平相比具有统计学意义,在雌性小鼠中,阳附片组较模型组的UCP1表达水平显著升高,雄性小鼠的各给药组较同性别模型组均有显著差异,其中阳附片的显著性最优;对于BAT中UCP1基因的相对表达量:同性别之间比较,模型组较正常组的UCP1 m RNA相对表达量显著下降,在雌性小鼠中,与模型组相比,阳附片组、生附片组和阴附片组的UCP1 m RNA相对表达量极显著升高;与阳附片相比,生附片和阴附片的UCP1 m RNA相对表达量也有显著性差异;在雄性小鼠中,与模型组相比,阳附片组的UCP1 m RNA相对表达量有显著差异,生附片、阴附片无显著性差异。此外,生附片组和阴附片组的UCP1 m RNA相对表达量与阳附片组比较也有显著性差异。3阴附片和阳附片调节脂质代谢途径的研究PKA通路是调节脂质代谢的重要途径之一,能够促进脂肪水解为甘油和游离脂肪酸,通过相应的方法对PAK通路的环磷酸腺苷(c AMP)和蛋白酶做了检测分析,结果得出:对小鼠BAT中c AMP的影响:对于雄性小鼠,模型组较正常组的c AMP含量有所降低,阴阳附片较模型组相比有所升高,但无显著性差异。对于雌性小鼠,模型组较正常组有显著降低,给药各组均能升高c AMP含量,其中生附子效果最好,其次为阳附片。对小鼠BAT中PKA蛋白表达的影响:对于雌性小鼠,各组之间的差异没有统计学意义,但给药组PKA蛋白的表达有一定的上升趋势,其中阳附片组上升趋势较好,较为接近正常组。对于雄性小鼠,与模型组相比,正常组和生附片组有显著差异,阳附片组和阴附片组有上升趋势,其中阳附片组的上升趋势较为接近生附片组。对小鼠BAT中PKA基因表达的影响:对于雌性小鼠,与模型组相比,正常组和阳附片组有极显著差异,生附片组和阴附片组的基因表达量有所上升;对于雄性小鼠,较模型组相比,正常组和给药各组有极显著差异,阳附片组的表达量最高。对小鼠BAT中HSL蛋白表达的影响:对于雌性小鼠,与模型组相比,正常组和阳附片组有显著差异,生附片组和阴附片组有上升趋势,阴附片组的上升趋势较生附片组的高。对于雄性小鼠,可能组内差异较大,雄性各组之间没有明显差异,但给药组HSL蛋白的表达有一定的上升,其中生附片组和阳附片组上升趋势较好。对小鼠BAT中HSL基因表达的影响:对于雌性小鼠,与模型组相比,正常组和给药各组有显著差异,阳附片组的基因表达量最高,这与HSL蛋白的表达相一致。对于雄性小鼠,HSL蛋白没表现出太大的差异,但是基因表达却有一定的差异性,较模型组相比,正常组和给药各组有极显著差异,阴附片组的表达量最高,但综合蛋白表达的结果分析得出:阳附片组更能有效激活HSL蛋白。本研究也使用试剂盒对甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白分别进行了检测,分析得出:对甘油三酯的测定:无论雌雄,与模型组相比,生附片组、阴附片组和阳附片组的甘油三酯也有降低(P<0.05);对于雄性,阳附片降低效果最为明显;对于雌性,阴附片降低效果最好。对高密度脂蛋白的测定:无论雌雄,小鼠模型组与正常组相比,高密度脂蛋白的值都明显降低(P<0.05);与模型组相比,生附片组、阴附片组和阳附片组的高密度脂蛋白显著性升高(P<0.05);生附片组、阴附片组和阳附片组三者相比无明显统计学意义。无论雌雄,都是生附子的效果最好,升高最为明显。对低密度脂蛋白的测定:对于雌性,与模型空白组相比,阳附片组的低密度脂蛋白显著降低(P<0.05);对于雄性,与正常组的低密度脂蛋白相比,与模型空白组相比没有显著性差异。结论:阳虚小鼠出现应激反应,促进下丘脑中AMPK的表达,影响了棕色脂肪组织的产热功能,使甘油三酯的脂质代谢功能也明显下降;给药后,阴附片和阳附片通过下丘脑AMPK蛋白--棕色脂肪组织--脂质代谢相关信号通路这一途径发挥了产热作用,其热性还是有所差异的,但两者男女异用的作用差异在此研究中尚未明显体现出来。总体而言,无论雌雄,阳附片和阴附片都有补火助阳的效果,阳附片的效果较好于阴附片,故建议在临床中,阳附片用于阳虚较严重者,阴附片用于阳虚较轻或体质较弱者。