论文部分内容阅读
小麦条锈病是由条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的一种世界性的真菌病害。在我国,条锈病是小麦常年发生的最严重的病害之一,曾在1950、1964、1990和2002年发生过4次破坏性极大的条锈病大流行,造成严重的产量损失。冬小麦品种小偃54对当前流行的条锈菌小种有良好的高温诱导抗性,当环境温度高于18℃时,即可诱导抗性的表达。这种高温诱导的抗性具有小种专化性较弱和持久性特点。自从1996年推广以来,小偃54一直保持对条锈菌的田间抗性。研究小偃54高温诱导抗条锈性的相关基因对阐明小麦高温诱导抗病性的分子机制和培育持久、广谱抗病性品种具有重要的理论意义与实用价值。
本研究利用cDNA-AFLP方法从接种条锈菌小种CY31的小偃54幼苗中筛选到一个高温诱导上调表达的基因TαSPX-MFS。进而对该基因进行了表达特性、在高温诱导抗条锈性中的作用、互作蛋白等方面的研究。获得了以下主要研究结果:
1.小偃54接种条中CY31后,分别于高温(22℃±2)和低温(12℃±2)条件下生长,在接菌后的0d、1d、1.5d、2d、3d、Sd、7d、9d取样和提取RNA反转录,采用cDNA-AFLP技术筛选到一个编码包含有SPX结构域的基因片段。该基因片段的表达水平在接菌后1.5d时(高温处理12h)达到高峰,且高温条件下的表达水平显著高于低温条件下的表达。
2.克隆了3个TaSPX-MFS基因的cDNA全长和基因组序列。序列分析表明,3个基因的开放阅读框长度均为2085bp(包含终止密码子TGA),编码694个氨基酸。基因组序列含有10个外显子和9个内含子。利用中国春缺体-四体系统和缺失系以及第9内含子序列长度多态性,将3个成员分别定位于第6同源染色体群的长臂上。根据全长cDNA推导的氨基酸序列在N端和C端分别有SPX结构域和MFS结构域。据此将3个基因分别命名为TaSPX-MFS-6A、TaSPX-MFS-6B昶TaSPX-MFS-6D。
3.组织表达谱分析显示,TaSPX-MFS主要在小麦叶部表达。上游启动子序列含有大量的光反应和ABA、SA和JA等激素反应元件。实时定量PCR数据表明Ta SPX-MFS的表达受光照、温度和激素SA及MeJA的调控,并且呈现24小时的周期性变化。小偃54地上部分TaSPX-MFS基因的转录水平不受磷饥饿的诱导。亚细胞定位实验表明TaSPX-MFS-6D-GFP融合蛋白定位在拟南芥原生质体细胞的细胞质膜。
4.利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的病毒诱导基因沉默(VIGS)系统,分别在SPX结构域编码区和3’-UTR区选择沉默诱导片段构建重组病毒。结果表明,两个重组病毒都显著降低了小偃54幼苗叶片中的TaSPX-MFS表达量。TaSPX-MFS表达量的降低使小偃54丧失了对条中CY31的高温诱导抗性。组织病理学观察发现,相对于对照(Mock)和侵染BSMV:GFP的植株,Ta SPX-MFS表达量降低的植株叶片中条锈菌丝的长度显著增长。说明Ta SPX-MFS基因参与了小偃54的高温诱导抗条锈病过程。
5.以TaSPX-MFS-6D为bait,利用split-ubiquitin酵母双杂交系统筛选条锈菌处理的小麦cDNA文库,获得了一个互作蛋白TaATG8(一种自噬蛋白)。在酵母中验证了它们之间的互作。