马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是马铃薯上重要害虫,也是我国重大检疫性对象。长期的化学农药施用致使马铃薯甲虫对多种药剂产生了抗药性。在新农药筛选过程中,发现氟虫腈、丁烯氟虫腈和硫丹影响马铃薯甲虫化蛹和羽化,具有生长调节剂活性。本文测定了这三种GABA非竞争性抑制剂对幼虫化蛹和羽化的影响,系统分析了马铃薯甲虫转录组数据,克隆及鉴定了部分营养平衡和激素信号转导途径基因,构建了营养和激素调控网络图,分析了亚致死剂量氟虫腈对马铃薯甲虫4龄幼虫中这一调控网络的影响,获得如下主要结果。1.三种杀虫剂对马铃薯甲虫和甜菜夜蛾羽化和化蛹的影响测定了氟虫腈、丁烯氟虫腈和硫丹对马铃薯甲虫4龄幼虫、成虫的触杀及胃毒毒力,结果表明4龄幼虫对这三种杀虫剂的敏感性均明显低于成虫；进一步测定发现这三种杀虫剂在亚致死剂量使用时均显著影响幼虫化蛹和羽化。对甜菜夜蛾的测定结果进一步确认了这一现象。这表明这三种GABA受体非竞争性抑制剂扰乱了昆虫的内分泌系统。为了进一步分析其干扰机理,还测定了马铃薯甲虫4龄幼虫启动变态的3个重要指标：关键体重82mg；到达关键体重和进入漫游期的时间分别为幼虫蜕皮后24h和80 h。2.马铃薯甲虫转录组分析应用Illumina测序技术获得马铃薯甲虫39641172个reads,进一步组装和聚类为63399条unigenes。同源搜索鉴定出23633条序列与已报道的基因同源(平均相似性为77%,其中33%为高度同源)和39766条新序列。初步揭示了23633条unigenes的分子功能及所属的24个COG类别和208个KEGG通路。综合注释信息,发现其中的423条基因的编码产物可能参与杀虫剂作用靶标和参与杀虫剂代谢、脯氨酸代谢、化学感受、蜕皮激素及保幼激素代谢、PTTH信号转导、类胰岛素肽信号转导和TOR信号转导。鉴定了马铃薯甲虫主要细胞色素P450 (CYPs)和鱼尼丁受体(RyR)基因,进一步证实了转录组数据的正确性。3.马铃著甲虫营养平衡和激素信号转导途径基因的鉴定基于马铃薯甲虫转录组数据,应用RACE技术克隆得到3个葡萄糖转运载体(LdGLUTl和LdGLUT2-isoform 1/2)、1个海藻糖转运载体基因(LdTreTl).5个脯氨酸代谢相关基因全长cDNA序列(LdProDH、LdP5CDh、LdALT-2、LdP5CS和LdP5CR)、12个类胰岛素通路相关基因、及4个蜕皮激素信号途径相关基因全长cDNA序列。分析了部分基因在不同发育阶段和／或不同组织中的表达。应用RNAi技术验证了5个脯氨酸代谢相关基因的功能,发现取食LdProDH-dsRNA菌液LdProDH表达量显著降低了80%,血淋巴中脯氨酸含量提高提高近1倍。连续取食3-6天表达LdP5CDh-dsSNA. LdALT-2-dsRNA. LdP5CR-dsRNA和LdP5CS-dsRNA的大肠杆菌分别降低了相应基因表达量(降低了51%-90%)、显著影响了成虫存活率(降低至53.3%-73.3%)、并减慢了成虫飞行速度。RNAi结果表明上述基因的编码产物在马铃薯甲虫行使了生物学功能。在此基础上,构建了马铃薯甲虫中营养平衡和激素信号转导途径。上述研究结果为进一步研究氟虫腈对马铃薯甲虫营养代谢调节机制提供了基础资料。4.亚致死剂量氟虫腈影响马铃薯甲虫化蛹的机理氟虫腈处理显著减小了马铃薯甲虫幼虫的摄食量,抑制了其蛋白酶和氨基酸转运载体基因的表达,降低了葡萄糖和海藻糖转运载体基因的表达,提高了4龄早期幼虫体内脯氨酸的合成和分解。这导致幼虫达到关键体重的时间延后8到12h。与此相反,氟虫腈处理并未延迟类胰岛素信号转导途径在蜕皮后24 h内的信号。马铃薯甲虫中,咽侧体抑制激素基因LdAS-B与LdAS-C在关键体重形成时间点(蜕皮后24 h)和漫游期开始时间点(蜕皮后80 h)形成两个峰值,失活咽侧体。氟虫腈处理后,蜕皮后24h的峰值被提前,蜕皮后80 h的峰值被抑制,使保幼激素合成酶如JHAMT基因的转录即使在蜕皮后80 h仍维持较高水平。此外,氟虫腈处理激活Halloween基因在4龄幼虫前期的转录而抑制在后期的转录,改变蜕皮激素合成和释放动态。氟虫腈对营养平衡、类胰岛素、保幼激素和蜕皮激素的影响引发变态信号转导途径的紊乱,从而使幼虫不能正常化蛹。