高粱全长cDNA文库构建和分析及玉米ZmBIP基因的功能鉴定

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作为禾本科作物中的C4植物,高粱具有高光合效率和高水分利用率的特点,它适应在高温和干旱地区种植,是一个典型的抗旱性较强的作物。全长cDNA文库包含大量含有完整阅读框架的基因。构建全长cDNA文库,是挖掘和利用高粱抗旱基因,规模化克隆和验证基因功能的重要途径。本研究的主要结果如下:1、提取干旱胁迫处理下高粱5个组织的RNA,采用了改良的Oligo-capping方法,构建了干旱胁迫响应相关高粱全长均一化cDNA文库。文库的库容量为2.24×106cfu,插入片段的平均长度大于1kb,重组率为93%。2、随机挑选了1万条单克隆进行5’端单向测序,经拼接处理得到4337个unigene。对4337个序列进行生物信息学分析,包括GO功能分类、转录因子分析、KEGG信号通路分析和基因组定位等。GO功能注释结果显示,受外界刺激响应的基因有152个,具有抗氧化活性功能的基因有50个,编码连接核苷酸的转录因子的基因有193个、具有电子传递活性功能的基因67个。这些基因可能参与植物的干旱响应信号途径。通过BLASTx程序与植物转录因子数据库中的氨基酸序列比对,确定了351个转录因子。其中ERF家族所占比例最高,为6.8%。WRKY家族基因、MYB_related家族、NAC家族基因,各占351个转录因子基因的5.9%、5.1%、4.8%。本研究挖掘到的转录因子,主要集中在与抗旱响应信号途径有关的转录因子家族中,编码这些转录因子的基因可作为功能验证的候选基因。KEGG信号通路分析结果表明,在光合组织的碳固定通路中,涉及到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PPC)、丙酮酸磷酸双激酶基因(PPDK)等;在过氧化物酶途径中,涉及到过氧化物酶家族基因(PEX1、PEX5、PEX6等)。全长文库unigene序列中有4071条序列定位到高粱基因组中,占93.87%。其中,3841条序列定位到基因组中单一位点,说明单拷贝的基因在高粱中所占比例较高。3、采用全长cDNA过表达系统(FOX系统)进行了高粱全长文库基因的功能验证。构建了高粱FOX系统,通过分子检测获得转基因阳性株系。4、分析了玉米抗旱自交系旱21中BIP基因家族的功能。经过荧光定量PCR验证,玉米中ZmBIP1和ZmBIP2基因均受甘露醇胁迫诱导有不同程度的下调表达。将ZmBIP1和ZmBIP2基因分别转入拟南芥中,过表达ZmBIP1和ZmBIP2基因导致其种子萌发时期对盐和甘露醇胁迫的耐受能力减弱,过表达ZmBIP2基因的转基因植株在生殖生长时期对盐胁迫敏感。推测ZmBIP1和ZmBIP2是植物响应逆境胁迫信号途径的负向调节子。
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