肝门部胆管癌(hilar cholangiocarcinoma)作为肝外胆管癌的一种，因其特殊的局部解剖位置和生物学特性，往往起病隐匿，早期诊断十分困难。手术切除是目前肝门部胆管癌治疗的主要手段。但由于肝门部解剖的复杂性和肝门部胆管癌位置的特殊性，肝门部胆管癌的手术风险巨大。目前，国内和国际上应用比较广泛的肝门部胆管癌术前分期、分型系统虽然对肝门部胆管癌的术前评估有着积极的影响，但也存在不足，还有待进一步完善。因此有效并合理的选择肝门部胆管癌的手术方式，将对提高根治性切除率，并最终提高患者生存期产生深远影响。 Wnt信号通路是一条在动植物体内高度保守的信号传导通路，调节并控制着诸多生命过程，包括生物体的生长、发育、疾病、衰老与死亡等；也包括细胞形态与功能的分化与维持、免疫、应激、细胞癌变与细胞凋亡等。经典Wnt信号通路也被称做Wnt/β—catenin信号通路，它的异常激活已被证明与多种肿瘤的发生、发展密切相关[3][4][5][6][13][14]。但是其在胆管癌尤其是肝门部胆管癌中的表达及激活却鲜有报道。 本研究旨在通过对临床病例的回顾分析，探讨不同分期、分型系统对肝门部胆管癌手术切除效果及预后的影响。并进一步通过组织芯片联合免疫组化技术，研究肝门部胆管癌组织中Wnt经典通路的表达及其异常激活与手术切除效果及预后的关系。同时，利用体外培养细胞系研究Wnt经典通路在不同胆管癌细胞系内的表达及激活情况。最后利用siRNA技术，探讨以Wnt经典通路为靶点的肝门部胆管癌基因治疗方法，为肝门部胆管癌的治疗提供更多可行的选择。 第一部分肝门部胆管癌的手术治疗及预后分析 一、目的： 探讨改良T—分期系统及Bismuth—Corlette分型系统对于肝门部胆管癌手术切除效果及预后的影响，并对影响手术切除效果及预后的相关因素进行分析。 二、方法： 回顾性分析我院自1997年4月～2007年5月10年间确诊为肝门部胆管癌并行手术治疗患者175例。评价建议性T分期系统及Bismuth—Corlette分型系统对肝门部胆管癌手术切除能效及预后的影响。并通过单因素及多因素分析，探讨肝门部胆管癌手术切除能效及预后的影响因素。 三、结果： Bismuth—Corlette分型系统和建议性T分期系统对于肝门部胆管癌手术切除能效的评估有重要作用，随分级等级升高手术切除率下降，但仍有待完善。 T分期的T1和T2期、Bismuth分型的Ⅱ型和Ⅲa型、联合右半肝切除、手术持续时间、肿瘤大体最小径可作为手术切除能效的独立影响因素。 Bismuth—Corlette分型系统和建议性T分期系统对肝门部胆管癌术后患者预后的影响均无意义。肿瘤的最大直径、肿瘤的最小直径、肝动脉受侵犯、入院ALT值、入院CA19-9值被认为是预后独立影响因素。 四、结论： Bismuth—Corlette分型系统和建议性T分期系统对于肝门部胆管癌手术切除能效的评估有积极作用，但对患者预后的影响无意义，可通过加入肝动脉侵犯、淋巴结转移、肿瘤大小等因素而完善。 第二部分 Wnt经典通路相关因子在肝门部胆管癌患者组织中的表达 一、目的： 研究肝门部胆管癌患者组织中Wnt经典通路相关因子及其靶基因的表达，探讨Wnt经典通路在肝门部胆管癌组织中异常激活的意义。 二、方法： 收集我院自1997年4月～2007年5月10年间确诊为肝门部胆管癌并行手术治疗之患者病理存档标本129例，以肝内胆管癌手术患者存档标本31例及先天性胆总管囊肿患者存档标本45例为对照组，构建组织芯片。采用免疫组化染色技术，检测Wnt经典通路相关因子及其靶基因的表达情况，对比其在不同疾病中的异同，并行相关性分析。通过单因素及多因素分析，探讨各指标表达及通路激活情况对肝门部胆管癌手术切除能效及预后的影响。 三、结果： Wnt2、β—catenin、TCF4在肝门部胆管癌中均有较高表达，且多以强阳性表达为主，其中Wnt2、β—catenin、TCF4的表达明显均高于肝内胆管癌；Wnt2、TCF4的表达则明显高于先天性胆总管囊肿。c—myc及cyclinD1在肝门部胆管癌中均有较高表达，与肝内胆管癌及先天性胆总管囊肿相比有明显差异。 Wnt经典通路在3组标本组织中均出现激活，以肝门部胆管癌内Wnt经典通路的激活水平为最高，明显高于先天性胆总管囊肿，但与肝内胆管癌相比无明显差异。 Wnt通路激活对于T分期、Bismuth分型、患者病理分级、淋巴结转移均无明显影响，对于患者生存时间亦无影响。 cyclin D1表达水平、Wnt通路激活、Wnt通路可疑激活为手术切除效果影响因素。其中cyclin D1的阳性表达为独立影响因素。 cyclin D1表达、Wnt通路可疑激活情况为预后影响因素。其中Wnt通路可疑激活为预后独立影响因素。 Wnt2表达与c—myc表达正相关，与Wnt通路可疑激活情况负相关。Wnt3表达与β—catenin胞浆表达正相关。Wnt通路激活与β—catenin及TCF4胞核内表达情况呈正相关。Wnt通路可疑激活与Wnt通路激活情况呈正相关。 四、结论： 在肝门部胆管癌组织中存在较高水平Wnt经典通路的激活以及其激活所引起的下游靶基因c—myc的表达。Wnt经典通路的激活及cyclin D1的表达对于肝门部胆管癌患者手术切除能效及患者预后有着重要影响。 第三部分 Wnt通路相关因子在胆管癌细胞系中的表达及其siRNA干扰实验 一、目的： 以体外培养的胆管癌细胞系为基础，进一步验证Wnt经典通路在体外培养胆管癌细胞系中的表达，并利用siRNA技术探讨抑制Wnt经典通路特定靶点从而抑制Wnt通路活化的可能，为肝门部胆管癌的基因治疗提供更多的选择。 二、方法： 按不同来源之体外培养胆管癌细胞系分组，利用RT—PCR技术、Western—Blot技术、免疫荧光染色技术分别从mRNA水平、蛋白水平检测Wnt经典通路相关因子及其靶基因的表达情况。 利用RNAi干涉技术，将靶向Wnt2及β—catenin的siRNA投递入细胞系FRH0201，利用RT—PCR技术、Western—Blot技术、免疫荧光染色技术、流式细胞仪技术、MTT细胞增殖检测方法分别从mRNA水平、蛋白水平、细胞周期、凋亡、增殖水平检测siRNA转染前后Wnt经典通路相关因子及其靶基因的表达情况。 三、结果： Wnt经典通路在体外培养肝门部胆管癌细胞系FRH0201及肝内胆管癌细胞系HCCC9810、SSP—25、RBE中均有激活，但其核心因子Wnt2、Wnt3、TCF4、β—catenin及其靶基因c—myc、cyclin D1在4种细胞系中的表达存在差异，以FRH0201中表达为高。 以lipofectamin2000为载体投递靶点分别为Wnt2和β—catenin的siRNA入FRH0201细胞系，投递效率超过50％，并明显敲低靶点基因表达，其mRNA水平沉默效率超过90％。转染该siRNA后可明显抑制Wnt经典通路的活性，并在转录水平下调c—myc的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制细胞的增殖。但对cyclin D1作用不明显。 四、结论： 体外培养胆管癌细胞系内存在Wnt经典通路的激活。靶向Wnt2和β—catenin的siRNA技术可做为肝门部胆管癌基因治疗的可能选择。