多种药物在个体和种族间的代谢呈现出显著差异性,对于治疗指数比较窄的药物,若不能预估其个体差异,就可能导致严重的毒性反应,甚至死亡。如果一个药物在用于临床之前,其在人群中的安全治疗范围可以预测,药物开发的效率将会得到改善。目前体外体内外推法(IVIVE,in vitro-in vivo extrapolation)使研究人员有机会在研究体内药代动力学之前获得药物体内代谢的定量数据。体外体内外推法(IVIVE),是用数学模型由药物体外性质(药物溶出的速率或程度)或体外药动学预测其体内特性(血药浓度或药物吸收量)或体内药动学的方法。由药物的体外内在清除率Clint,in vitro预测体内肝清除率(CLh)是IVIVE的重要研究之一。目前应用较多的体外清除率数据主要来源于肝微粒、肝细胞、肝切片等。肝微粒体的体外内在清除率(Clint,in vitro)是体外数据的主要来源之一。随着研究的不断深入,IVIVE的研究方法日趋增多,本研究总结以往的预测方法,选择其中应用较广的三种方法(Obach-fup,Rb法、Berezhkovskiy-fup,app,Rb法与Poulin-fuliver,Rb法)预测9种CYP探针药物(CYP1A2探针非那西汀、CYP2A6探针-香豆素、CYP2B6探针-安非他酮、CYP2C8探针-紫杉醇、CYP2C9探针-甲苯磺丁脲、CYP2C19探针-奥美拉唑钠、CYP2D6探针-右美沙芬、CYP2E1探针-氯唑沙宗、CYP3A探针-咪达唑仑)的体内肝清除率。并采用平均折合误差(Average-fold error,afe)评价药物体内肝清除率预测的准确度,当afe值在0.5-2.0范围内时预测准确。本研究还考虑了药物微粒体蛋白游离率(药物在微粒体混合体系中的游离率(fum))对预测准确度afe的影响,测定了药物在本实验室条件下的fum值。以评价fum对预测准确度afe的影响。预测体内肝清除率的参数主要有每克肝微粒体蛋白的含量(MPPGL)、肝脏重量(LW),肝血流量(Qh)和体重(BW)等五个参数,目前体内CLh预测的研究,普遍采用这些参数的平均值进行预测,忽略了参数个体值的变异,以致无法预知药物在体内代谢的个体差异。本研究采用五种参数的个体值,预测药物的体内肝清除率,考察五种参数个体值的变异对预测结果个体差异的影响。同时,研究还考虑了预测方法对预测结果个体差异的影响。以期,为预测药物体内肝清除率的个体差异提供依据,为预测药物临床治疗范围的研究提供参考。方法1药物微粒体蛋白体游离率(fum)的测定测定5种探针药物的fum(紫杉醇与咪达唑仑因文献报道的fum值,与本实验室所用的微粒体蛋白浓度一致,研究不再测定)。首先,在空白体系(不含人肝微粒体)中,采用超滤法测定药物在高中低三个浓度下通过超滤膜的比率;再在不同浓度的微粒体蛋白体系(非那西汀-0.3mg/ml,香豆素-0.3mg/ml,甲苯磺丁脲-0.5mg/ml,奥美拉唑钠-0.5mg/ml,右美沙芬-0.2mg/ml)中,测定高中低三个浓度的超滤液中游离药物的浓度;最后,用药物在空白体系中的通过率校正计算得到混合肝微粒体体系中实际游离药物的浓度,以计算药物的fum值。2数据的收集收集本实验室测定的105例样本的体外内在清除率(Clint,in vitro)、每克肝脏微粒体蛋白的含量(MPPGL)、肝脏重量(LW),肝血流量(Qh),体重(BW)/体表面积(BSA)等五种参数。3体内肝清除率(CLh)的预测采用Obach-fup,Rb法、Berezhkovskiy-fup,app,Rb法与Pouli-fuliver,Rb法等三种方法预测药物的体内肝清除率CLh,评估预测方法对药物体内CLh预测准确度的影响;引入药物的fum值预测药物的体内肝清除率,评价其对预测准确度的影响。4体内CLh个体差异的预测及其影响因素采用Clint in vitro、MPPGL、LW、Qh、BW等五种参数的个体值预测药物的体内肝清除率,评价五种参数个体值的差异对预测结果个体差异的影响。采用三种预测方法预测药物体内CLh的个体差异,评价预测方法对预测准确度的影响。5预测准确性(afe)评价预测的准确性是用平均折合误差afe(Average-fold error)值评价。两倍的预测精密度限制是允许的,对应afe值是0.5-2.0。一个方法预测完全准确的afe值是1。6统计方法采用SPSS17.0统计软件对各项数据资料进行统计学分析。对于非正态分布的数据,采取非参数检验进行相关分析。检验水准α为0.05,P<0.05认为有统计学意义。结果1药物微粒体蛋白游离率(fum)1.1药物超滤膜的通过率空白体系(不含人肝微粒体)中,香豆素、甲苯磺丁脲在三个浓度的通过率一致,平均通过率分别为88.94%、93.86%、79.4%,计算这三个药物的fum值时,采用平均通过率进行计算。而右美沙芬在高中低三个浓度的通过率不同,且随浓度增加通过率与有增加趋势,分别为94.45%(320μM)、88.40%(40μM)、80.56%(10μM),非那西汀在高中低的游离率分别为:94.44%(400μM)、95.79%(50μM)、86.97(12.5μM)%,与奥美拉唑钠79.0%(7.832μM)、76.0%(62.5μM)、83.2%(250μM),因此,计算非那西汀、右美沙芬与奥美拉唑钠fum值时采用其对应浓度的通过率。1.2药物微粒体蛋白游离率(fum)5种探针药物分别在其高中低三个浓度所测的fum值,没有统计学差异,取三个浓度的平均值做为该药物的微粒体蛋白游离率fum。非那西汀(0.3mg/ml)、香豆素(0.3mg/ml)、噢美拉唑钠(0.5mg/ml)、甲苯磺丁脲(0.5mg/ml)、右美沙芬(0.2mg/ml)在对应微粒体蛋白浓度下的fum值分别为:97.22%、94.01%、90.8%、97.66%、93.36%。五种探针药物在特定的微粒体蛋白浓度体系中的游离率较大,均大于90%。2预测的9种CYP探针药物体内CLh2.1三种方法预测药物的体内肝清除率9种CYP探针药物,安非他酮与氯唑沙宗均是口服制剂,没有静脉给药的体内清除率数据,本研究不做其预测的准确度评价。其他7种探针药物采用Obach-fup,Rb法甲苯磺丁脲与咪达唑仑两个药物的预测值在体内清除率的2倍范围内(其afe值分别为0.57、2.03),预测准确;Berezhkovskiy-fup,app,Rb法的预测结果,只有咪达唑仑预测准确,其afe值为2.03;采用Poulin-fuliver,Rb法预测,预测结果均在2倍范围之外。三种方法,Obach-fup,Rb法预测准确度较高。2.3 fum值对预测准确度的影响三种方法的预测准确度方面,咪达唑仑(afe值≥2),当加入fum值预测时,afe值增大,预测准确度降低;其他6个药物(预测值低于实测值),当加入fum值预测时,afe增大,预测准确度增加(甲苯磺丁脲Obach-fup,Rb法虽预测准确(afe值为0.57),但仍属偏低预测)。对于预测不准确的探针药物,采用fum值校正后,未达到预测准确性的要求,即预测结果在体内观测值得2倍范围之外。3预测探针药物体内CLh的个体差异范围3.1五种参数对预测CLh个体差异的影响对于第2部分预测准确的甲苯磺丁脲与咪达唑仑,两个药物的CLh的个体差异分别为49.7倍、21.3倍,其95%PI的差异分别为25.0倍、5.1倍。五种参数个体值的差异,对预测结果个体差异影响最大的是MPPGL(个体差异分别为:2.5倍与12.5倍)与Clint,in vitro(个体差异范围为:24.2倍,24.7倍),其次是体重、肝重与肝血流量(个体差异范围都约在2倍范围内)。其中肝血流量的个体值差异对预测结果个体差异影响最小。3.2预测方法与fum值对体内CLh个体差异的影响同一方法预测9种CYP探针药物的体内CLh,采用fum值校正后,甲苯磺丁脲与紫杉醇的个体差异没有变化,其他5种探针药物预测结果的个体差异倍数均减小。未加入fum值预测时,不同方法之间,预测结果的个体差异也不同,除甲苯磺丁脲外,其余探针药物体内CLh个体差异最大的是Obach-fup,Rb法预测的,其次是Berezhkovskiy-fupapp,Rb法,CLh个体差异最小的是Poulin-fuliver,Rb法。这个结果,在加入fum值校正的结果中,也可以见到。结论1.药物微粒蛋白游离率(fum)较大,药物体内肝清除率预测准确性不依赖于fum值的校正,但fum值可以改善药物的预测准确度。2.三种方法预测9种探针药物CLh,Obach-fup,RB法预测准确度较高,9种CYP探针药物中甲苯磺丁脲与咪达唑仑预测准确。3.甲苯磺丁脲与咪达唑仑预测的体内肝清除率CLh个体差异较大(21.3-49.7倍),预测参数(Clint in vitro、MPPGL、LW、Qh、BW)个体值的变异对预测结果的个体差异有影响,Clint in vitro、MPPGL影响较大;预测的体内肝清除率CLh的个体差异也受预测方法与fum值的影响。